基于单细胞拉曼技术的病原菌鉴定及耐药性快速检测的新方法研究

The antimicrobial resistance has become a serious threaten for human health. To tackle this global challenge, it is urgent to develop rapid and precise diagnostic approaches both for identification of pathogens and for determination of antimicrobial resistance, so as to accomplish “precise medicine” for combating infections and to control the spread of antimicrobial resistance. To meet the demand, a novel integrated method based on single-cell Raman technology is presented for the rapid detection of both identity and resistance of bacteria in this proposal. Firstly, single-cell Raman spectroscopy will be employed to build up a database of Raman phenotype as well as a train-test model for the most frequently encountered bacteria that lead to infections, realizing the rapid identification of bacterial species at single-cell level without cultivation. Secondly, SIP(steady-isotope-labeling)-based Raman spectroscopy will be applied to rapidly determine the bacterial resistance based on the metabolic features of heavy water in individual cells under antibiotics. Finally, single-cell Raman sorting and genomic techniques will be integrated for validation of the above Raman methods at the genetic level, and for confirmation of the diagnosis in case of clinical practice. In summary, an innovative single-cell Raman diagnostic system will be established based on a work flow of “rapid microbial identification----rapid resistance determination----genetic validation/diagnosis confirmation”, which we believe should provide more precise and efficient tools for clinical applications.

抗生素耐药性问题已经成为人类健康的严重威胁。面对这一全球性挑战，亟待开发快速准确的病原菌鉴定及其耐药性诊断方法，以实现对临床细菌感染的“精准”治疗，从而控制细菌耐药性的发展和传播。针对这一迫切需求，本项目提出了一种利用单细胞拉曼技术进行病原菌快速鉴定和细菌耐药性快速检测的一体化诊断新方法。首先，单细胞拉曼光谱技术被用以建立常见病原细菌的拉曼表型数据库和检验模型，从而实现在单细胞水平上不经培养的病原菌类型快速鉴定；其次，利用稳定同位素拉曼标记技术，基于抗生素作用下细菌对重水的代谢差异，实现对细菌耐药性的快速判断；同时，结合单细胞拉曼分选和基因组技术在基因水平上对上述方法进行验证和确诊，从而最终建立一套“病原菌快速鉴定——耐药性快速检测——基因组学验证/确诊”的创新性单细胞拉曼诊断系统，为临床应用提供更为精准、高效的方法和工具。

病原菌快速鉴定及抗生素耐药性快速检测在临床上具有迫切需求，本项目即针对这一难题，提出并成功实施了一种基于单细胞拉曼技术的常见病原细菌快速鉴定及其耐药性快速检测的新方法研究与开发示范工作。首先，项目成功建立了几种常见病原菌的单细胞拉曼表型数据库和区分模型，实现了无需培养的临床病原菌种类快速鉴定；其次，首次利用重水代谢差异原理，成功建立了基于重水拉曼标记方法的细菌耐药性检测技术，整体操作流程可在3小时内完成；另外，本项目发展和改进了一系列单细胞拉曼分选的方法和工具，可以精确完成对特定功能细胞的单细胞分选和基因组测序，从而实现对拉曼表型检测、病原类型及其功能基因的鉴定和确认。利用上述方法与工具，成功完成了临床尿液病原菌样本的快速鉴定和耐药性诊断方法和流程的示范，与传统培养方法相比，临床菌株鉴定准确率可达97%以上，耐药测试一致性超过90%；同时，以口腔菌群为例开展了复杂菌群中的单细胞分析与测序，成功完成一种潜在病原细菌罗氏菌的单细胞遗传刻画；另外，项目开展了单细胞拉曼技术在复杂功能微生物群落解析中的应用示范，成功证实单细胞拉曼技术能够直接耦合表型与基因型关联，直接从分子层面研究功能类群构成及功能行使路径，为未来开展对人体共生菌群的群体耐药分子机制研究奠定了技术基础。同时，本项目还开发了基于表面增强拉曼（SERS）技术的细菌表型鉴定和耐药性快速检测方法，可作为单细胞方法的有益补充。本项目的顺利完成为病原菌及其耐药性的快速检测以及耐药机制研究提供了新的方法和工具。