重要赤潮藻的并行定量检测新技术—膜斑点-双特异性探针杂交

对赤潮原因种进行正确鉴定，并建立简单、快速的检测方法是研究和防治赤潮的前提和基础。本研究拟建立一种能并行定量检测赤潮藻的新技术-膜斑点-双特异性探针杂交。项目首先通过PCR扩增、克隆测序或直接从GenBank检索获取主要赤潮藻的rDNA序列，经比对分析设计捕获和检测探针，然后设计和制备膜探针阵列；同时提取多种赤潮藻的rRNA，分别完成膜探针阵列的第一次和第二次杂交；经显色反应后，根据斑点灰度参考预制备的定量标准进行目测定量和精确定量，建立膜斑点-双特异性探针杂交的实验室检测技术；通过实验室模拟自然样品，优化膜探针阵列、靶核酸的制备及核酸杂交条件，并最终将其用于自然样品的定量分析。项目的完成可改变当前大多分子技术一次只能检测单种赤潮藻的现状，并克服现行的DNA微阵列技术不能定量检测、技术要求和检测费用高及实用性差的缺点，具有较强的实用性，对赤潮预警和赤潮藻的种群动态分析具有重要应用意义。

赤潮是当前全球性的环境问题，而赤潮藻的鉴定与检测是进行赤潮研究的前提和基础。应用分子生物学方法对赤潮藻进行快速鉴定和检测是当前赤潮生物学和生态学研究的热点问题。本研究建立了一种能并行定量检测多种赤潮藻的新技术—膜斑点-双特异性探针杂交。项目首先通过基因组DNA的提取、PCR扩增、产物纯化及分子克隆和测序获取了几种重要主要赤潮藻的核糖体大亚基rDNA D1-D2区序列，经比对分析设计了捕获和检测探针，并对探针的特异性进行了测试，然后设计和制备膜探针阵列，并建立了膜斑点-双特异性探针杂交的实验室检测技术；对几种重要杂交参数进行了优化,包括捕获探针在膜基上的点样量、探针固定时间、靶核酸上样量、杂交温度、杂交时间、洗膜温度和时间等；建立了定量检测标准曲线，并最终将其用于模拟自然样品和自然样品的定量分析。项目的完成建立了一种简单快速的赤潮藻的并行定量方法，为海洋水环境监测和赤潮藻生态学研究提供了一种便捷的工具，具有一定的现实应用意义。项目完成时发表了6篇论文（均为SCI检索），申报获得国家发明专利3项（全部授权），培养硕士研究生2人，研究成果参与申报获得省部级奖励1项（海洋科学进步奖二等奖），达到预期成果要求。