CARD9相关的宿主免疫缺陷在暗色丝孢霉病发病中的作用研究

Phaeohyphomycosis is a group of superficial, cutaneous, subcutaneous or systemic infections caused by diverse dematiaceous fungi. With its prolonged course, recalcitrant lesions and disseminations, this disease is intractable and may be life-threatening. These clinical features highly suggest that some underlying immunodeficiencies should be considered in its progression and prognosis. In a previous study published by the applicant's group, we reported CARD9 mutations in 4 patients of pheohyphomycosis, with marked decreased proportions and cytokines of Th17 cells and impaired immune responses against Phialophora verrucosa. However, the exact mechanism of how CARD9 takes part in the pathogenesis of pheohyphomycosisis is still unknown. This proposed study will focus on Phialophora verrucosa and Exophiala spinifera as the representatives of dematiaceous fungi, and study how CARD9 deficiencies affect antifungal functions of macrophages, DC cells and neutrophils, as well as Th cells differentiation. Furthermore, we will verify, in vivo, the role of CARD9 related immunodeficiencies in pheohyphomycosis through CARD9 knockout mice. Our study aims to demonstrate CARD9 related immunodeficiencies in the pathogenesis of pheohyphomycosis, and may serve as a potential target for developing new immunotherapies in the future.

暗色丝孢霉病是指一组由暗色真菌感染引起的皮肤、皮下组织及系统性感染，其病程迁延、顽固难治、少数可播散，严重影响患者生活质量甚至威胁生命。我们前期原创性地发现了疣状瓶霉致暗色丝孢霉病患者存在CARD9缺陷、Th17细胞反应下降以及天然免疫细胞对疣状瓶霉免疫应答的缺陷，由此提出CARD9异常所致宿主抗真菌免疫缺陷可能是该病的发病过程中重要的因素。为阐明CARD9相关的宿主免疫缺陷在暗色丝孢霉病发病中的确切机制，本申请拟选取疣状瓶霉和棘状外瓶霉为暗色真菌代表，通过体外实验明确暗色丝孢霉病中CARD9缺陷对巨噬细胞、DC细胞、中性粒细胞功能以及适应性免疫Th细胞分化的影响；并利用CARD9基因敲除小鼠模型，在体内验证CARD9相关的宿主免疫缺陷在暗色丝孢霉病发病过程中的作用。本课题的实施将为开展针对顽固性丝状真菌肉芽肿的特异性免疫治疗提供重要的理论依据。

暗色真菌所致的暗色丝孢霉病，病程迁延、顽固难治，严重影响患者生活质量甚至威胁生命。我们根据前期原创性的工作提出由于CARD9异常所致宿主抗真菌免疫缺陷可能是该病发病过程中的重要因素。本课题拟阐明CARD9相关的宿主免疫缺陷在暗色丝孢霉病发病中的确切机制，通过体内、体外实验明确暗色丝孢霉病中CARD9缺陷对巨噬细胞、DC细胞、中性粒细胞功能以及适应性免疫Th细胞分化的影响。在本研究中，本课题组首先结合既往及临床新收集的共8例暗色丝孢霉病患者进行相关遗传学的研究，发现患者均存在CARD9基因突变，突变影响正常CARD9蛋白的表达。进一步利用患者外周血细胞进行的免疫学研究发现，与正常人相比，患者外周血单核细胞、中性粒细胞对真菌孢子的吞噬作用和ROS无明显变化，但外周血单个核细胞在真菌刺激下对于趋化因子、促炎细胞因子、以及NF-κB转录活性均等明显低于正常对照，从而导致了适应性免疫细胞因子、Th17/22细胞分化的缺陷。为了进一步探究CARD9相关的宿主免疫在暗色丝孢霉病发病中的作用，本课题组引进Card9基因缺陷小鼠进行了相关的动物研究。体内研究部分，选取疣状瓶霉、裴氏着色霉、卡氏枝孢瓶霉、棘状外瓶霉为代表，Card9缺陷小鼠在临床表型、生存率、足垫肿胀率、菌载量、组织病理学方面表现出对暗色真菌的普遍易感性，局部细胞因子分泌等方面与野生小鼠比较有显著性缺陷。体外研究部分，体外诱导小鼠骨髓来源的巨噬细胞和树突状细胞，证实了CARD9缺陷影响了NF-κB及p38MAPK的活性、相关细胞因子的表达，并通过混合淋巴细胞实验证实其影响了Th17细胞的分化。综上，本课题组在患者、小鼠层面进行了体内、体外相关研究，证实CARD9突变通过影响天然免疫细胞信号传导以及细胞因子分泌，进一步影响下游Th细胞分化，从而造成暗色丝孢霉病易感性的具体机制。本研究丰富了CARD9缺陷相关临床疾病谱，印证了CARD9相关的宿主免疫缺陷在暗色真菌感染中的重要作用，也为我们今后在临床工作中开展针对顽固性丝状真菌肉芽肿的免疫治疗提供和奠定了重要的理论依据。