镇痛抗肿瘤缬精甘肽的结构与功能关系研究

利用生物信息学技术结合关联性研究结果，预测蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽功能活跃区域。利用基因工程技术，对功能活跃区域的氨基酸残基分别进行突变，通过定量检测突变体的镇痛和抗肿瘤生物活性，确证活性肽的镇痛、抗肿瘤功能区域及其功能密切关联氨基酸残基。通过活性肽及其突变体的远紫外CD光谱分析突变体二级结构含量变化，结合生物学信息分析该突变点氨基酸残基与活性肽结构维系关系以及属性，探讨功能密切关联位点对活性肽功能影响的作用机制。利用膜片钳以及流式细胞仪，初步探讨活性肽及其突变体的生物活性与人钠离子通道亚型Nav1.7的关系。研究工作，不仅为拥有原创性自主知识产权的镇痛抗肿瘤活性肽新药研发及其深层次新药开发提供理论依据和物质基础，为生物大分子结构与功能关系补充理论资料，也为基于钠离子通道的镇痛、抗肿瘤药物作用靶点，由此建立筛选评价体系奠定坚实物质基础、理论依据，为发扬光大祖国传统医药宝库,尝试、开拓新思路。

利用生物信息学技术结合关联性研究结果，预测了蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽分子表面四个功能活跃区—以N-端十个左右氨基酸残基片段为核心区域-区域1；以两个β片层的首尾形成的β转角为核心区域-区域2；以C-末端部分氨基酸残基片段为核心区域-区域3；以α螺旋为核心区域-区域4。同时依据评价值的高低，确定了区域1的5、8、9位；区域2的51、52、54位；区域3的64、65、66位；区域4的18、19、21位氨基酸残基为潜在关联性氨基酸残基。针对上述预测的四个功能活跃区域潜在关联性氨基酸残基共计12个位点分别进行突变，并通过基因工程表达制备了系列突变体。通过体内镇痛和体外抗肿瘤生物活性实验，考察了系列突变体的镇痛和抗肿瘤生物活性变化情况以及程度，同时利用CD分别分析上述系列突变体二级结构含量的变化情况。结果表明：蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽有三个区域与其生物活性具有关联，即区域1、区域2、区域3；功能活跃区域1的8和9位、区域2的52和54位、区域3的65和66位氨基酸残基与活性肽的生物活性具有关联性。. 针对上述六个位点氨基酸残基再次分别进行了一系列突变，生物活性实验结果表明：1.活性肽54位氨基酸残基R侧链通过形成氢键、8和9位氨基酸残基R侧链的羧基通过形成离子键参与了与Nav1.7的结合或及调控其活度；2.活性肽C末端荷正电能够显著提升活性肽与钠离子通道的结合或及调控其活度，反之亦然；3.区域β转角方位，与其生物活性密切相关，且该β转角越向分子内靠近，其生物活性越高，反之生物活性越低。. 考察了蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽及其功能相关系列突变体对HEK293-Nav1.7的钠离子影响及其作用强度。实验结果表明：蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽能够显著调控人Nav1.7的活度；活性肽与其生物活性密切关联氨基酸残基及其突变体的生物活性，与其对Nav1.7活性的影响具有相关性；镇痛活性区域及其密切关联氨基酸残基的镇痛生物活性，与其对Nav1.7活性的影响是一致。. “蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽突变体及其制备方法”已获得中国知识产权局的发明专利授权。已发表学术论文四篇，其中国外学术期刊（SCI）一篇；已有三篇论文被国外期刊（SCI）接受；本项目的研究主体—蝎镇痛抗肿瘤缬精甘肽的突变体，已经作为抗肝癌候选药物，申请并获得国家十二五科技重大专项-重大新药创制-创新药物-生物药物临床前研究专项资助。