东亚钳蝎抗神经兴奋肽结构与镇痛关系的研究

以具有镇痛活性的东亚钳蝎抗神经兴奋肽II（BmK ANEPII）为研究对象，利用软件模拟BmK ANEPII、钠离子通道1.7（Nav1.7）的site4初始三维结构模型，采用分子力学和分子动力学技术对模建结构分别在水环境、膜环境进行优化，通过蛋白质-蛋白质分子对接技术预测BmK ANEPII镇痛活性域，并以此为理论依据采用蛋白质工程技术通过定点突变方法构建单位点和多位点BmK ANEPII突变体，并对纯化的系列重组BmK ANEPII突变体在实验动物水平检测镇痛活性。利用膜片钳全细胞记录模式和激光扫描共聚焦显微镜技术,研究确定活性肽对神经细胞内离子浓度的影响。通过计算机动力学模拟和生物学实验两层面综合分析确定BmK ANEPII镇痛活性域。为研究蝎活性肽结构与功能关系提供新思路。为揭示蝎毒镇痛活性肽的治疗作用机制，设计和开发具有自主知识产权的高疗效无成瘾性镇痛多肽药物提供科学依据。

采用同源模建、力学优化、动力学优化、分子对接等方法获得小鼠钠离子通道1.7（mNav1.7）位点4静息态和激活态与ANEPⅡ的膜环境下的作用模式，结果显示： ANEPⅡ与mNav1.7位点4识别和激活的功能位点主要分布在N-groove疏水区和“药效团”区，提示这些区域可能与镇痛活性密切相关； 根据所预测的区域，设计并通过位点导向突变PCR技术获得14个突变体，小鼠醋酸扭体镇痛模型中，预测的ANEPⅡ功能区域中“药效团”区的L15、E24、K23，β2-β3转角的W36、T37、W38，NC结合处K11、T59、K6364突变为Ala后镇痛活性显著性提高；这些突变体的模拟结构分析提示：ANEPⅡ的N-groove变大、C-groove变小以及NC端的结合方式与镇痛活性相关，C-末端的稳定结构并不是镇痛活性所必需。. 从系列多肽中筛选镇痛效果好的多肽GKK，采用福尔马林模型实验方法，对GKK的镇痛作用进行研究。实验结果表明，GKK能显著抑制福尔马林引起的疼痛反应，其中对Ⅰ相神经痛的抑制作用具有剂量依赖性。提示，GKK具有显著的镇痛作用。Western Blot实验结果表明，I能够剂量依赖的抑制福尔马林致痛模型小鼠DRG神经元Nav1.8通道蛋白的表达。提示，GKK可能通过调节钠离子通道发挥其镇痛作用。. 应用膜片钳全细胞记录模式对GKK可能的离子通道机制进行了考察。首先建立急性分离大鼠背根神经节神经元的实验方法，采用免疫细胞化学染色方法鉴定细胞形态，并使用膜片钳技术考察其电生理特性。结果表明，急性分离的DRG神经元形态结构完整，细胞上表达的Na+通道快速激活和失活，其Na+通道最大电流密度出现在-20 mV左右。采用膜片钳全细胞记录模式，考察给予GKK前后，钠总电流及TTX-R亚型Nav1.8电流的变化。实验结果表明：GKK（3 nM-30 nM）能以浓度依赖的方式抑制Na+总电流，30 nM时抑制率为31.2%。；GKK可使Na+的激活曲线向细胞膜内电位负值增大的方向移动9.33 mV；失活曲线向细胞膜内电位负值增大的方向移动3.0 mV； GKK可显著抑制Nav1.8电流，使Nav1.8电流激活曲线向细胞膜内电位负值增大的方向偏移23.18 mV。