两栖动物镇痛肽odorranaopin结构与功能研究

Amphibian opiate peptides including dermorphins and deltorpins have been recently found only in the skin of South American frogs belonging to the subfamily Phyllomedusinae (Phyllomedusa, Agalychnis and Pachymedusa species).No opiate peptides have ever been identified from other amphibians or organs except skin. Recently we report a novel antinociceptive peptide named odorranaopin from the homogenates of the frog brains(Biochimie), Odorrana grahami, which is also the first antinociceptive peptide found in Ranidae amphibian.Our previous work indicated that odorranaopin have a strong analgesic activity,could inhibit the contractile responses of ileum smooth muscle induced by bradykinin.On the basis of our previous work, this work will process odorranaopin with site-directed mutation,and investigate its structure-function relationships,finally lay a foundation for designing and developing a high-performance and specific analgesic peptide.

目前，两栖动物阿片类镇痛肽仅在南美叶泡蛙亚科（Phyllomedusinae）的一些种（Phyllomedusa, Agalychnis and Pachymedusa species）的皮肤分泌液中有发现，如dermorphins和deltorpins，在其他的两栖动物或器官中尚未发现，最近，本课题组报道了一种新型镇痛肽odorranaopin （Biochimie,2011），该肽来源于无指盘臭蛙（Odorrana grahami）脑匀浆液，是首次在蛙科中发现的镇痛肽，前期研究显示，该肽具有很强的镇痛活性，能够抑制由bradykinin诱导的回肠肌收缩。本项目拟在前期工作基础上，定点突变odorranaopin,对这些分子突变体进行结构与功能研究，找到其结构和功能关键位点和氨基酸残基，识别该肽发挥其功能的结构与功能关系及分子机制，为设计、利用高效、专一作用的镇痛肽奠定基础。

两栖动物阿片类镇痛肽仅在南美叶泡蛙亚科（Phyllomedusinae）的一些种的皮肤分泌液中有发现，如dermorphins 和deltorpins，在其他的两栖动物或器官中尚未发现，最近，本课题组报道了一种新型镇痛肽odorranaopin （Biochimie,2011），该肽来源于无指盘臭蛙（Odorrana grahami）脑匀浆液，是首次在蛙科中发现的镇痛肽，前期研究显示，该肽具有很强的镇痛活性，能够抑制由bradykinin 诱导的回肠肌收缩。我们在Odorrana grahami皮肤中研究发现了一种新型镇痛多肽 Analgesin-HJ, FWPVI-NH2，通过在用昆明小鼠构建的镇痛模型中包括小鼠扭体实验、福尔马林实验、摆尾实验及热板实验，以吗啡作为阳性对照研究这种多肽具有的镇痛效果。采用侧链相似，理化性质和极化状态相近的氨基酸残基进行改造，实现对odorranaopin的定点突变。根据odorranaopin的结构特点设计了以下10个突变体，测定这些突变体的基本性质，并进行了人工化学合成。利用镇痛动物模型筛选出具有高效镇痛作用的突变体。实验发现，突变体IX具有最好的镇痛活性。比较了野生型和IX计算结构的差异发现K15-R15的突变增加了分子侧面的电荷，这种改变可能造成odorranaopin分子与其作用位点作用力的改变，从而增加了其生物学活性。测定阿片受体拮抗剂纳洛酮（naloxone）对odorranaopin镇痛作用的影响，发现纳洛酮可以抑制odorranaopin的作用。纳洛酮对中枢和外周阿片受体均有效，是一个非特异性的阿片受体抑制剂。这些结果说明odorranaopin作用于阿片受体。利用选择性阿片μ-受体拮抗剂cyprodime、选择性阿片δ-受体拮抗剂naltrindole、选择性阿片κ-受体拮抗剂5'-GNTI等，对odorranaopin及odorranaopin IX镇痛作用的受体选择性研究表明，它们均主要作用于阿片μ-受体。本项目在前期工作基础上对新型镇痛多肽odorranaopin进行了结构与功能研究，找到了其结构和功能关键位点和氨基酸残基，研究了该肽发挥其功能的分子机制，为设计、利用高效、专一作用的镇痛肽奠定了基础。