绒山羊精子上的精卵融合相关蛋白之间相互作用的鉴定

Sperm-egg fusion is one of the key steps in mammalian fertilization. However, the mechanisms by which acrosome-reacted spermatozoa bind to oolemma and the subsequent fusion with the oolemma remain unknown except that a dozen of proteins with putative roles in sperm-oocyte fusion have been identified both on sperm and egg, among which eight are located on the sperm, including IZUMO1, CRISP1, CRISP2, PDIA3, SPACA3(SLLP1), Equatorin, SPESP1 and TSSK6, whereas CD9 and some unknown GPI-anchored proteins are on the oocyte. These proteins all do not have stereotypical features of a fusogen or SNARE protein, thus could not mediate membrane fusion directly. They may function coordinately with each other during the process of sperm-egg fusion. Therefore it is urgently to clarify the interaction patterns among these proteins for elucidating the molecular mechanisms of mammalian sperm-egg fusion. However there are only a few reports that IZUMO1 can bind to TSSK6 on sperm. Our lab had found that cashmere goat PDIA3 can bind to TSSK6, CRISP2, IZUMO1, suggesting there are complicated interactions among these gamete fusion related proteins on sperm. Therefore we design this project to identify and characterize the potential interaction and the domain or motifs that mediate the interaction among all the eight proteins on sperm using Co-IP analyses, yeast two-hybrid and GST Pull-down techniques. The colocalization on sperm pre- and post acrosomal reaction of those protein pairs with interaction will also be determined for helping draw interaction patterns.

精卵融合是哺乳动物繁殖成功的关键过程之一，但对其分子机制知之甚少，只在精子和卵子上分别鉴定出若干影响精卵膜融合的蛋白，但这些蛋白都没有融合素或者SNARE蛋白的结构特点，不可能是其中某一种蛋白聚合引发膜融合，应该是通过相互作用介导精卵膜融合。在精子上的8种精卵融合相关蛋白中目前只探明IZUMO1能与TSSK6结合，尚无其它精卵融合相关蛋白之间相互作用的研究报道。申请人前期实验发现绒山羊PDIA3能与TSSK6、CRISP2、IZUMO1等相互作用，提示精子上的精卵融合相关蛋白之间存在复杂的相互作用，因此本项目拟用免疫共沉淀、酵母双杂交、GST Pull-down等技术全面鉴定绒山羊精子上的精卵融合相关蛋白之间的相互作用，并找到介导其相互作用的结构域或者基序。在明确某对蛋白相互作用的基础上，进一步观察其在顶体反应前后精子上的共定位，最后归纳出它们介导精卵膜融合的相互作用模式.

有性生殖成功的关键之一是雌雄配子融合。雌雄配子融合是由雌雄配子细胞表面的特异性蛋白相互识别并介导雌雄配子膜靠近直至融合。尽管对低等动物配子融合的分子机制有所了解，但对哺乳动物精子与卵子融合的分子机理却知之甚少。虽然已鉴定出10多种影响精卵融合的配子蛋白（以下称精卵融合相关蛋白），但只发现精子的IZUMO1与卵子的JUNO相互作用为小鼠精卵融合所必需。缺失IZUMO1的精子或JUNO的卵子都不能与正常卵子或精子融合；但分别表达IZUMO1和JUNO的体细胞也不能融合，说明IZUMO1和JUNO还需要其他辅助蛋白才能促成精卵融合。目前尚无其他精卵融合相关蛋白之间相互作用的研究报道。本项目以绒山羊和绵羊蛋白为材料，辅助以大鼠蛋白，用酵母双杂交和免疫共沉淀技术鉴定了精子上13种精卵融合相关蛋白的相互作用，发现蛋白二硫异构酶PDIA3与IZUMO1、IZUMO4、CRISP1、CRISP2、TSSK6、SLLP1、TMEM190均有相互作用，睾丸特异性丝氨酸苏氨酸激酶TSSK6与IZUMO1、IZUMO4、PDIA3也有相互作用，而SPESP1、IZUMO2、MN9、Equatorin等可能与其他蛋白无直接相互作用。上述结果提示PDIA3等若干精子蛋白可能在精子上形成“受精复合体”，其中PDIA3是“组织者”，通过其酶活性重排其他蛋白的二硫键，引发整个复合体构象变化；IZUMO1是“排头兵”（之一），识别卵子上的JUNO，搭建起精子膜与卵子膜的联系；TSSK6可能是蛋白复合体的“发动机”，通过其激酶活性磷酸化复合体中的某些蛋白，引发整个复合体动态变化，驱使精卵膜靠近直至融合。本项目的发现是解析哺乳动物精卵融合分子机制的重大突破。