大鼠Izumo1与卵子表面、Pdia3及CD9结合的研究

精卵融合的分子机制是受精生物学和细胞生物学最重要的基础理论问题之一。Izumo1是目前鉴定出来的唯一专门介导精卵融合的精子蛋白，但对其功能却几乎一无所知。为了探讨Izumo1是否通过与卵子表面的某种未知因子结合而介导精卵融合、决定Izumo1与卵子表面结合的关键位点是它的哪一段肽链以及Izumo1与另外两个精卵融合相关分子Pdia3和CD9能否结合，本项目拟用模式动物大鼠进行3方面研究：1）Izumo1在睾丸和精子上的定位；2）将Izumo1肽链分成免疫球蛋白样结构区等7个区段，分别在原核细胞中与GST融合表达，用间接免疫荧光技术研究Izumo1肽链的不同片段与去透明带的卵子表面结合的能力以及这些片段对精卵融合的影响；3）Izumo1与CD9和Pdia3的结合能力。项目研究结果不仅对探明哺乳动物精卵融合的分子机制，而且对研究体细胞融合和发展基于细胞膜融合原理的生物技术也有重要的参考价值。

项目克隆了大鼠IZUMO1、CD9、PDIA3的cDNA序列，并原核表达制备了多克隆抗体。观察到大鼠IZUMO1在精子上主要分布在顶体内膜上，在细胞膜（包括尾部）上也有；在精细管里精子发生的各个阶段细胞的细胞质中均有。PDIA3分布在精子顶体和尾部，在精子发生过程中位于从精原细胞到成熟精子的所有细胞中。RNA原位杂交结果显示大鼠Pdia3基因从精原细胞到成熟精子的减数分裂各个时期都转录，精原细胞（或者初级精母细胞）的转录量略大。在大肠杆菌中表达并纯化了IZUMO1成熟肽胞外区和免疫球蛋白结构域等若干片段的GST融合蛋白，发现IZUMO1成熟肽和其免疫球蛋白结构域片段均能与去透明带的的卵子表面结合，但免疫球蛋白结构域下游的胞外段不能与卵子结合。提示卵子表面存在IZUMO1的受体，而且是跟IZUMO1的免疫球蛋白结构域结合。项目还发现IZUMO1和PDIA3成熟肽均能与CD9成熟肽共沉淀，说明卵子上的CD9有可能直接与精子上的IZUMO1及PDIA3等蛋白结合，从而介导精卵膜靠近并融合。上述结果均为原创性新发现（未发表），是本领域研究中的一个重要突破，为阐明IZUMO1和CD9这两个精卵融合的关键性蛋白的功能开辟了路线，也为哺乳动物精卵融合的分子机制研究指出了新的目标，即：鉴定卵子上IZUMO1的结合配体和研究蛋白之间相互作用及其作用后的结果。