对虾与白斑综合症病毒之间表面蛋白相互作用的大规模筛选与鉴定

WSSV (White Spot Syndrome Virus), one of the most important and prevalent pathogens in shrimp, presents a major challenge to global shrimp culture industry。Up to nowadays, there is no effective drug or stratage can prevent or control the epidemic of WSSV. Currently, the mechanisms of WSSV infection shrimp are still uncovered. Specifically, the host cell receptor of WSSV remains unknown. Characterization of the interactions between the WSSV envelope proteins and host cell surface proteins is critical to the host cell receptor research. However, due to the large genome of WSSV (encodes over 20 envelope proteins) and the lacking of WSSV infection cell model, existing methods are not available for the systematic host-pathogen interaction research. To break through the limitation, we intended to improve the traditional Pull-Down method：The biotinylated WSSV envelope proteins are used as bait to fish the host cell surface interactive proteins, which can be identified by shotgun-MS/MS. The innovative method was named as Affinity Chromatography based Surface Proteomics (ACSP). We believe that it will play a very important role in high-throughput screening of the protein-interactions between WSSV and shrimp, which could provide a basis for WSSV-cell receptor research and developing effective medicines and therapeutic strategies for treating WSSV infections.

白斑综合征病毒(WSSV)严重威胁着全球对虾养殖产业，迄今尚无能够有效防控WSSV疫情的药物和措施。而目前对WSSV感染对虾的机制仍然缺乏明确认识，特别是尚不清楚WSSV的病毒受体。筛选病毒囊膜蛋白与宿主细胞表面的相互作用对WSSV的病毒受体鉴定十分关键。但由于WSSV基因组较大，囊膜蛋白众多，以及缺乏有效的WSSV感染宿主细胞模型等原因，无法有效地应用现有的技术手段进行系统性的病原-宿主蛋白互作研究。因此本项目拟对传统的Pull-Down技术进行改进：利用生物素化修饰的WSSV囊膜蛋白作为诱饵，大规模垂钓其对虾细胞表面受体蛋白并进行shotgun质谱鉴定。将该方法称为基于亲和层析的表面蛋白质组学，它能够高效地大规模筛选对虾细胞表面的WSSV互作蛋白。在此基础上，研究这些蛋白与其配体的结合对WSSV感染宿主的影响，为今后的WSSV的病毒受体研究和白斑综合症防治策略的开发奠定基础。

白斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus , WSSV） 能够感染多种甲壳类动物，也严重威胁了对虾养殖业。深入了解WSSV与宿主之间的表面蛋白-蛋白相互作用对于阐释病毒的分子致病机制非常关键。为此，我们采用一种基于生物素化的亲合层析方法，以多种WSSV囊膜蛋白为诱饵来垂钓与之结合的凡纳滨对虾鳃细胞膜蛋白。最终鉴定出LvBiP （Litopenaeus vannamei immunoglobulin heavy-chain-binding protein）是一种新型的WSSV结合蛋白。在本研究中我们还发现该蛋白位于凡纳滨对虾鳃和血细胞的表面。我们利用Pull-down和ELISA技术证实了LvBiP蛋白与WSSV之间结合的特异性和ATP依赖性。免疫荧光试验结果显示WSSV与LvBiP蛋白共定位于对虾血细胞的表面。进一步通过免疫共沉淀试验验证了WSSV与LvBiP蛋白在对虾体内的结合。抗体中和研究结果表明使用抗LvBiP的兔多克隆抗体可以部分抑制WSSV与对虾鳃细胞膜蛋白的结合并降低了对虾感染WSSV的死亡率，说明细胞表面的LvBiP蛋白是WSSV的一个黏附位点。通过RNA干扰降低对虾的LvBiP蛋白表达水平后，对虾感染WSSV的死亡率有了更为显著的下降，暗示该蛋白在WSSV感染的过程中发挥了重要作用。之前的研究中普遍认为LvBiP蛋白主要存在于内质网，是一种属于HSP70家族的分子伴侣和热休克蛋白，而本研究结果首次报道其作为对虾细胞表面的一种WSSV结合蛋白，为深入研究WSSV的感染机制，开发相关的防控技术提供了参考和新的靶点。此外，我们还将这种基于生物素化的亲合层析方法应用于其它水产病原与宿主相互作用机制研究领域，发掘了一批副溶血弧菌的粘附宿主细胞相关外膜蛋白，充分说明我们建立的这种方法非常适合快速、高效地筛选病原与宿主间的相互作用蛋白，值得今后的进一步推广应用。