精子发生相关小蛋白的鉴定与功能研究

Small proteins are a class of proteins encoded by short ORFs (open reading frames). They have been hitherto overlooked due to the difficulty to discover. They have been gradually recognized as the technologies develop, and may perform diverse important regulatory functions. There is lack of systemic study of small proteins in reproductive system, especially in spermatogenesis in male gonad. Previously, our laboratory provided evidence that testis expressed many novel small proteins, and found that testicular lncRNAs can encode small proteins. In this study, we will incorporate methods of proteomics, bioinformaics, cellular biology and molecular biology,, and use the the mouse model and clinical human samples to construct a database of mouse and human testicular small protein profile, and to study their functions. The aim of this study is to characterize a series of novel small peptides in testes, to provide evidences that one important function of lncRNA in testis is to encode small proteins, to study the roles of small proteins in spermatogenesis and the roles of small peptides in male infertility, and help develop future male contraceptives.

小蛋白是一类由短读码框架编码的蛋白质，由于其发现困难在前面的研究中一直被忽视，最近由于技术的发展逐渐被关注，其可能发挥着多种重要的调控功能。在生殖系统尤其是雄性性腺精子发生过程中，尚无系统的研究。本实验室前期研究表明睾丸中有很多新的小蛋白表达，发现睾丸lncRNA编码小蛋白可能是一种重要的调控机制。本研究将结合小鼠模式动物和临床人群标本，运用蛋白质组学、生物信息学、细胞生物学和分子生物学方法，构建小鼠和人睾丸小蛋白表达谱，并进行功能研究。发现一系列睾丸表达的新的小蛋白，说明翻译小蛋白可能是lncRNA发挥功能的重要机制，阐明小蛋白在精子发生中的作用，以及与男性不育的关系，为将来开发避孕药物提供新的靶标。

非编码RNA的功能逐渐受到关注。由于其序列特征，lncRNA与circRNA传统被认为不具有蛋白编码功能，但其可能通过编码小蛋白发挥功能的特性最近受到关注。本研究围绕睾丸表达的小于30kD的小蛋白进行蛋白质组学解析，结合RNA seq数据分析，鉴定57个lncRNA编码的蛋白与18个circRNA编码蛋白，并围绕circRNA编码蛋白特点构建在线数据库circRNADb。. 围绕发现的lncRNA编码的人鼠保守小蛋白TSlncEP7进行深入研究，发现TSlncEP7受到睾丸特异的转录后调控，其RNA水平多组织均有表达，但仅在睾丸组织中存在于多聚核糖体组分，蛋白水平呈现为睾丸特异表达，说明小蛋白在精子发生过程有着特殊的调节作用。定位研究显示TSlncEP7在睾丸PLZF阳性精原细胞表达。其蛋白序列具有人鼠保守的N端保守区域、不保守的C端区域以及两者间的连接区域，体外细胞研究发现其连接区域具有核定位功能，超表达可以导致细胞G2/M期阻滞； 其N端区域与H2B相互作用，与C端区域一起调节H2bK20ac修饰。通过使Tsep7提前终止编码而不影响其对应反义链编码的Tmem33蛋白，构建TSlncEP7蛋白水平敲除小鼠，发现可以引起PLZF阳性精原细胞增殖增加，G2/M期缩短，有丝分裂进程加快。免疫共沉淀显示TSlncEP7与P300存在相互作用，促进组蛋白H2b K20位点的乙酰化修饰水平升高，维持核小体的相对稳定性。TSlncEP7敲除后，精原细胞的H2bK20ac荧光信号下降，ChIP-seq和ATAC-seq分析显示在基因结构区域TSEP7敲除主要导致TSS区域H2bK20的乙酰化水平降低，开放程度增加，促进了大量转录负调控的mRNA的表达。TSlncEP7作为lncRNA编码的睾丸特异小蛋白，在精子发生过程中具有重要的调控作用。