假肥大型肌营养不良症Dystrophin基因重复及点突变的修复研究

Pseudohypertrophic muscular dystrophy is caused by mutations in dystrophin gene. There is currently no effective clinical treatment. Most of researches are focus on gene therapy, and the main strategies include exon skipping, stop codon read-through and Crispr/Cas9 gene editing. However, these technologies are mainly used for deletion and nonsense mutations, rarely involving duplication and point mutations. Our previous study successfully removed large duplicated DNA sequence and expressed full-length dystrophin protein with the application of Crispr/Cas9 technology on myoblast cells carried exon 18-25 duplications. In addition, myoblasts and iPS cell lines with various mutations in dystrophin gene were also established, and the mdx mouse model was also introduced. Based on the well-prepared foundation, this project will use Crispr/Cas9 technology on both myoblast and iPS cells to repair a variety of duplicated mutations of dystrophin gene; At the same time, with the application of the latest reported single-base editing technology BE3 and ABE system, accurate repairing for point mutations in dystrophin gene will be performed on myoblasts and mdx mice, which may provide a new direction and basis for the treatment of this disease in the future.

假肥大型肌营养不良症由dystrophin基因突变所致，目前在临床上尚无有效治疗手段。基因治疗是其研究的焦点，主要策略有外显子跳跃、终止密码子通读及Crispr/Cas9基因编辑等，这些技术主要针对外显子缺失和无义突变，极少涉及重复及其它点突变。我们前期应用Crispr/Cas9技术在18-25号外显子重复突变患者来源的成肌细胞上成功实现了重复序列的完整删除，并表达出全长dystrophin蛋白。此外，还建立了各种dystrophin基因突变型成肌细胞及ips细胞系，引进了mdx小鼠模型。本项目将基于良好的前期基础，采用Crispr/Cas9技术从成肌细胞及iPS细胞两个方面对dystrophin基因各种重复突变进行修复；同时，应用最新报导的单碱基修复技术BE3和ABE系统，从成肌细胞和mdx小鼠水平对dystrophin基因各种类型点突变进行原位精确修复，为本病的治疗提供新的方向和依据。

本项目在前期研究的基础上，开展了如下研究：1、从临床诊断方面出发，持续开展DMD患者的诊疗，鉴定了c.4518+512T>A 深部内含子突变导致mRNA间接过程中插入内含子序列造成移码突变，导致dystrophin蛋白缺失，为DMD罕见突变，拓宽了DMD的基因突变谱，为患者提供明确的产前诊断依据。2、继续完善DMD队列研究，收集分析dystrophin基因突变谱，收集患者成纤维/成肌细胞进行重编程，得到了多种DMD iPSCs模型，为后续诱导分化、基因编辑研究打下坚实基础。3、应用CRISPR/Cas9系统在成肌细胞层面对Dystrophin基因第18-25号重复突变的进行切除修复，修复后全长dystrophin蛋白表达量明显增加，该研究证实通过CRISPR-Cas9切割的方案，在成肌细胞上可对长达69724bp的重复片段进行修复，为后续成体治疗提供了科学的依据。4、利用CRISPR/dCas13x REPAIR系统在RNA水平修复Dystrophin基因c.4714 C>T无义突变，在人源化DMD小鼠体内，通过肌肉定点注射，可达到高达84%的A-to-G编辑效率，通过AAV全身给药分别将膈肌、胫骨前肌和心肌中的dystrophin蛋白表达平均恢复到WT水平的37%、6%和54%，并显著改善了小鼠抓力、转棒等运动功能表现，为遗传性疾病的RNA修复治疗提供了有力的依据。上述系列研究结果为DMD的基因治疗研究提供了多项理论依据，利用多种基因编辑工具在不同类型的突变上进行修复，课题组目前正进一步开展其他类型DMD小鼠的成体治疗研究中，有望将该治疗方法实现临床应用转化。本系列研究已发表论文8篇，培养了3名博士研究生及1名硕士研究生。