烟草细胞自噬关键因子Beclin1/ATG6结构与功能研究

Beclin1/ATG6is a well-known key regulator of autophagy，which is implicated in numerous biological process, including adaption to stress, development, immunity, aging, and cell death.However, the molecular mechanism by which Beclin1 functions remains largely unkown,and researchs are few on the roles and binding proteins of plant-sourced Beclin1. This project uses the model organism,tobacco, as the material;the molecular structure of tobacco Beclin1 will be resolved by recombinant expression and crystallographic process; tobacco Beclin1 binding proteins will be screened and verified by combination of yeast two-hybrid, bimolecular fluorescence complementation, and transient gene expression mediated by agroinfiltration; the gene function of tobacco Beclin1 will be revealed through the research of transgenic tobacco with Beclin1 overexpression or RNAi, together with the transcription analysis. Alltogether, this project will reveal the regulation mechanism of Beclin1 to the autophagic process, and explore the role of Beclin1 in the process of plant aging, death and virus infection, which thus promote the research progress of plant Beclin1 and autophagy.

Beclin1/ATG6是一个公认的细胞自噬关键调控因子，参与到多种生理过程，如对胁迫的适应、发育、免疫、衰老、死亡等。但是，Beclin1作用的分子结构基础还很不明确，对植物Beclin1的功能和结合蛋白的研究也十分缺乏。本项目以模式生物烟草为研究材料，通过重组表达和纯化烟草Beclin1，培养蛋白晶体，解析烟草Beclin1的蛋白晶体结构，为Beclin1的功能研究提供分子结构基础；结合酵母双杂交、双分子荧光互补和农杆菌转化烟草的基因瞬时表达技术筛选和验证烟草Beclin1的结合蛋白；通过烟草Beclin1基因的过表达和RNAi转基因烟草的构建，结合烟草Beclin1的表达分析，研究烟草Beclin1的基因功能；综合分析，揭示植物Beclin1对细胞自噬的调控机制，探索植物Beclin1及细胞自噬在衰老、死亡和病毒侵染过程中所发挥的作用，从而推动植物Beclin1和细胞自噬的研究进程。

细胞自噬是广泛存在于真核生物中的生命现象，在进化过程中高度保守，其中Beclin1/ATG6是一个公认的细胞自噬关键调控因子。但是，Beclin1/ATG6作用的分子结构基础还很不明确，对植物Beclin1的功能和结合蛋白的研究尤为不足。本项目以模式生物烟草为材料，围绕Beclin1/ATG6蛋白的纯化与晶体学研究、结合蛋白的筛选以及其基因功能研究开展。实际执行过程中，一直未拿到蛋白晶体，针对其它研究内容经过三年的研究，主要获得了以下结论或成果：.1、项目建立了检测烟草细胞自噬现象的荧光标记技术体系，有利于后续烟草细胞自噬的研究。.2、酵母双杂交筛选到8个烟草Beclin1/ATG6蛋白的候选结合蛋白，尚未有这几个蛋白与Beclin1/ATG6互作的报导。.3、第一次在植物中验证了植物源Ambra1与Beclin1/ATG6存在真实互作。植物Ambra1是否存在一直是不明确的，本项目第一次在烟草中证明这个与哺乳动物Ambra1序列相似性非常低的基因同样可以与Beclin1/ATG6互作。.4、烟草Beclin1/ATG6基因与烟草胁迫抗性紧密相关。不同胁迫条件下烟草Beclin1/ATG6基因表达上调，且与细胞自噬标记基因ATG8具有相似的表达模式，表明该基因通过细胞自噬参与烟草的胁迫抗性；降低烟草中Beclin1/ATG6基因的表达量，可导致烟草抗性减弱。.5、烟草Beclin1/ATG6基因VIGS沉默植株呈现早衰表型。VIGS沉默烟草Beclin1基因后，新生叶片出现斑状失绿，并逐渐衰老死亡，叶绿体内噬锇颗粒增多、淀粉粒明显减少、叶绿体数目变少。.6、代谢组分析表明Beclin1/ATG6基因沉默主要影响到烟草的基础代谢——C/N代谢。该基因沉默叶片中的碳水化合物如葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇等含量增加，半胱氨酸、丝氨酸等含量减少。.7、项目对Beclin1/ATG6蛋白进行了纯化和复性尝试，获得了截短的可溶蛋白和合适的复性条件，有利于下一步获得蛋白晶体。.本项目研究结果为下一步深入研究、了解Beclin1/ATG6指出了方向和重点，在对代谢组和Ambra1相关研究结果撰写成文后，下一步主要就两方面进一步加强研究，一是烟草Beclin1结合蛋白的筛选与验证，及结合蛋白对细胞自噬的调控功能研究；二是继续尝试Beclin1的晶体培养和结构研究。