ATM介导自噬分子Beclin1磷酸化修饰的新功能解析

Autophagy plays an important role in the occurrence and development of malignant tumor, and the Beclin1 is a key molecule which involved in the regulation of autophagy. The complex of Beclin1 and III type PI3K (hVsp34) plays a critical role in autophagosome formation. Our recent study found that, inhibtion of the activity of ATM could induce the autophagy in cancer cells. By the bioinformatics analysis, it is revealed the presence of potential ATM phosphorylation motif in the Beclin1 protein, and this motif may be the binding site of 14-3-3 protein which is the important serine/threonine phosphorylation binding-protein. Our experimental results of co-immunoprecipitation showed that the activation of ATM could increase the combination of ATM and Beclin1 in cancer cells. Thus,our hypothesized that, ATM may be negatively regulated the autophagy through phosphorylation on Beclin1, and induce the binding of 14-3-3 protein with this phosphorylated motif, then inhibit the hVsp34 activity and autophagy.In this project, we will confirm this hypothesis by using transmission electron microscopy, immunofluorescence, co-immunoprecipitation, GST pull-down and in vitro kinase activity analysis etc.It would provide a new understanding of the molecular mechanism for the regulation of autophagy through Beclin1.

自噬在肿瘤的发生发展中起着重要作用，Beclin1是参与自噬调控的中心分子,它与III型PI3K（hVsp34）形成复合物在自噬体形成中起着关键作用。我们近期研究发现，抑制肿瘤细胞内ATM蛋白激酶活性能够促进细胞自噬发生；通过生物信息学分析发现在Beclin1蛋白序列中存在ATM的潜在磷酸化位点,并可能同时也是14-3-3蛋白的结合位点；免疫共沉淀实验显示ATM的活化可以促进ATM和Beclin1的结合。基于此,我们提出了科学假设: ATM可能磷酸化Beclin1,14-3-3蛋白则与磷酸化后的Beclin1结合,从而抑制Beclin1通过调节hVsp34所介导的细胞自噬,以实现ATM对细胞自噬的负调控。本课题将应用透射电镜、免疫荧光、免疫共沉淀、GST pull-down、体外激酶活性分析等技术来验证这一科学假说，将为以Beclin1为核心的自噬调控的分子机制提供新的认识。

自噬是细胞生存和维持组织稳态的重要机制。研究发现，细胞自噬受到DNA损伤信号的调控，而ATM在DNA损伤反应中发挥着重要的作用，但其在细胞自噬调控中的作用仍未阐明。本研究中，我们发现了电离辐射或者DNA损伤药物引起肿瘤细胞内ATM 磷酸化活化，下调Beclin1的蛋白稳定性和表达水平，进而抑制细胞内p62阳性包涵体样结构( ALIS)介导的选择性自噬。进一步研究发现，磷酸化活化的ATM通过上调泛素连接酶ARFBP1和RNF190，并促进泛素酶与Beclin1的结合，从而抑制Beclin1 K63多聚泛素化反应和蛋白稳定性。另外，研究还发现，在DNA损伤刺激信号作用下，Beclin1能够特异性的通过BH3结构域、ECD结构域与磷酸化ATM、RNF190结合；通过ECD结构域与ARFBP1结合。综上，本研究首次证明，DNA损伤刺激信号诱导肿瘤细胞内ATM激酶磷酸化活化，抑制Beclin1 K63位多聚泛素化，负性调控细胞内p62依赖的ALIS选择性自噬的新机制。这一研究将为以Beclin1为关键分子的肿瘤细胞自噬调节的分子机制研究，特别是放疗条件下细胞自噬调节机制的深入研究提供新的思路。在项目执行期间，本课题组已经发表SCI研究论文3篇，关键数据已经投稿2篇，培养博士研究生2人，硕士研究生3人。