细胞自噬调控蛋白WIPI3的结构与功能研究

Autophagy is a catabolic process for the degradation and recycle of the cellular components that include denatured biomacromolecules and damaged cell organelles through the lysosomal machinery. This process plays critical roles in controlling cell growth, homeostasis, immunity and tumor genesis. The evolutionary conserved WIPI proteins (WIPI1 to WIPI4) are required for the formation and elongation of autophagosome at the initial stage of autophagy. WIPI1,WIPI2 and WIPI4 have been found to play diverse roles in the formation of autophagosome. However, whether WIPI3 also participates in regulating autophagosome formation and the underlying molecular mechanism both remain to be determined. The available data demonstrated that WIPI3 contains the similar seven WD40-repeats and is able to bind PIP lipid membranes, indicating that it may also play a vital role in autophagy regulation. In this proposal, we will focus on the structural and functional studies of the WIPI3/PIP lipid complex by using the biochemical, structural and cellular methods. The study will not only reveal the molecular basis for the PIP lipid recognition by WIPI3, but also provide some insights into the essential roles of WIPI3 in autophagy.

细胞自噬是在一定条件下细胞内变性、受损或衰老的大分子物质或细胞器被运输到溶酶体降解再利用的过程。细胞自噬可以维持细胞稳态、并在细胞生长、免疫、肿瘤发生过程中起重要作用。序列保守的WIPI蛋白（WIPI1到WIPI4）参与调控细胞自噬初期自噬小体的形成过程。WIPI1、WIPI2和WIPI4都被发现以不同作用方式参与调控自噬小体的生成，但WIPI3是否参与自噬调控及其调控的分子机理一直都不清楚。根据现有研究，WIPI3含有与其他WIPI蛋白类似的7个重复WD40结构域，并可以结合PIP脂质，暗示WIPI3可能在自噬调控中也发挥重要作用。本项目将综合运用生物化学、结构生物学及细胞生物学等方法，对WIPI3进行结构与功能研究，重点研究其与脂质结合的选择特异性及相关脂质复合体的结构和功能。通过研究将阐明WIPI3的结构特征及其结合PIP脂质的分子机制，为深入研究WIPI3如何参与自噬调控提供基础。

细胞自噬是指细胞通过对其内容物进行降解和循环再利用的过程，在真核细胞中高度保守。通过自噬，细胞得以维持内稳态、避免蛋白无序聚集体等有害物质的积累以及抵御病原菌入侵。自噬的起始依赖于自噬前体膜上磷脂酰肌醇-3磷酸（PI(3)P）的合成。WIPI蛋白是哺乳动物自噬过程中PI3P的下游效应分子，在自噬小体形成中发挥重要的作用。目前对WIPI家族成员的研究，还有很大的空白。综合运用分子生物学、结构生物学以及细胞生物学等方法，本项目对人源WIPI家族成员开展了结构与功能研究。本项目体外重组表达了人源WIPI蛋白，利用重组WIPI蛋白进行磷脂结合实验，结果表明WIPI蛋白都能够特异性识别磷脂肌醇PI(3)P和PI(3,5)P2。为了解释WIPI蛋白特异性识别PI(3)P和PI(3,5)P2的分子机制，本项目优化了蛋白表达条件，最终获得了性质均一的WIPI3蛋白。利用蛋白质晶体学，解析了WIPI3蛋白高分辨率三维结构。结构分析发现，WIPI3呈现七叶螺旋桨状折叠；其第五和第六桨叶分别包含一个保守的磷脂酰肌醇结合位点（位点1和位点2）。结构比对以及分子动力学模拟研究揭示了WIPI3的这两个磷脂肌醇结合位点对于PI(3)P和PI(3,5)P2具有选择特异性：位点1倾向结合PI(3,5)P2，而位点2结合PI(3)P。另外，本项目证实了WIPI3/4和ATG2相互作用位点，进一步的细胞生物学实验证明，破坏WIPI3/4和ATG2的相互作用可以影响自噬。总之，通过本项目的研究，揭示了WIPI蛋白的结构特征及其识别磷脂肌醇的分子机制，并初步揭示了WIPI3/4蛋白识别ATG2的分子机制，基本阐明了WIPI3蛋白在自噬中发挥的功能。