诱导耐药鸡毒支原体的比较蛋白质组学研究

动物源病原菌耐药性已经成为国内外关注的热点。鸡毒支原体是一种危害严重的病原体，给养禽业造成极大的经济损失。大环内酯类抗生素是兽医临床防治鸡毒支原体感染的首选药物，但鸡毒支原体对该类药物的耐药性日益严重，而耐药机制尚不完全清楚。已有的报道主要运用分子生物学技术研究耐药相关性的基因，尚未有从蛋白质水平进行鸡毒支原体耐药性的研究。本项目拟运用高通量的蛋白质组学技术，以鸡毒支原体的敏感株和大环内酯类诱导耐药株为研究对象，构建鸡毒支原体耐药株和敏感株的蛋白表达差异谱，以及耐药株在药物作用压力下的蛋白表达差异谱，为深入研究耐药株的差异蛋白的结构和功能及其介导的耐药性机理奠定基础。

本研究成功获得畜禽专用大环内酯类药物泰乐菌素的体外诱导鸡毒支原体耐药株，利用其作为耐药模型建立和优化分析鸡毒支原体蛋白质组的二维凝胶电泳方法，并进一步利用二维荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）进行分离和分析鸡毒支原体敏感株与泰乐菌素耐药株蛋白质组的差异。差异蛋白点经酶切后用超高效液相色谱-飞行时间质谱进行分析，成功鉴定出13个差异蛋白，其中8个上调，5个下调。选取热休克蛋白（DnaK-HSP70）和ATP合成酶β亚基（ATPB），运用蛋白免疫印迹技术（Western blot）进行定量分析，对2D-DIGE的分析结果进行验证。另外，对于不同浓度药物压力下的耐药菌株，运用多反应监测质谱（MRM-MS）定量技术对无机焦磷酸酶（Inorganic pyrophosphatase）和磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase）这两个下调蛋白的表达量进行了验证。对差异表达蛋白质的生物学功能和蛋白相互关系的分析表明，延伸因子G、延伸因子Tu、ATP合成酶β亚基、热休克蛋白、GrpE蛋白、无机焦磷酸酶、磷酸甘油酸激酶、bifunctional protein FolD等8个蛋白与耐药性密切相关，推断鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药机制有以下3个方面：（1）催化甲酰四氢叶酸的形成，以促进起始tRNA的甲酰化；（2）改变能量代谢方式，提供能量储备；（3）延伸因子过量表达，促进tRNA与核糖体的结合，以及核糖体构像的改变，以抵消泰乐菌素的阻断作用。本项目首次从蛋白质层面对鸡毒支原体的耐药机制进行了研究，为深入全面阐明其耐药机理开辟了新的方向。