酿酒酵母硫酸盐还原途径中调控硫化氢生成的分子机制研究

Hydrogen sulfide is an undesirable by-product during wine fermentation produced by Saccharomyces cerevisiae, which leads to "rotten egg" flavor in wine and has seriously negative effect on the flavor and sensory quality of wine. Using the metabolic engineering methods to modify wine yeast is the ultimate way to solve the boring problem introduced by hydrogen sulfide in winemaking. This project is trying to select the key genes in the sulfate reduction pathway which can lead to the significant expression differences between low and high hydrogen sulfide producing Saccharomyces cerevisiae strains by using yeast gene expression chips and quantitive Real-Time PCR. After that, these screened genes will be cloned, sequenced and expressed to verify their functions. Gene induced expression and modification of promoters will also be carried out to find out the regulation mechanisms. The result of this study will have great interests on exploring the molecular biology mechanism of hydrogen sulfide production in Saccharomyces cerevisiae. And it also has practical significance on controlling the production of hydrogen sulfide during winemaking process effectively.

硫化氢是酵母菌在葡萄酒酿造过程中生成的、具有臭鸡蛋气味的副产物，严重破坏葡萄酒风味。对酿酒酵母进行代谢工程改造，是解决葡萄酒硫化氢产生的根本途径。本项目选用从我国野生酿酒酵母种质库中筛选的低产及高产硫化氢的菌株，利用酵母全基因组表达谱芯片和荧光实时定量PCR技术，筛选并确认硫酸盐还原途径中，与硫化氢合成相关的显著表达差异基因，进而进行表达差异基因的克隆与测序，以及通过对这些基因的诱导表达和启动子区改造，研究它们在硫化氢合成代谢中的调控作用。研究结果对深入理解酿酒酵母硫酸盐还原途径中硫化氢产生的分子机制，具有重要的科学意义，对于有效控制葡萄酒酿造过程中硫化氢产生，具有重要的实践意义。

硫化氢（H2S）是一种具有臭鸡蛋气味的挥发性物质，严重损伤葡萄酒的感官品质。酿酒酵母自身在发酵过程中合成的H2S，是葡萄酒中H2S的重要来源之一。 本项目通过筛选获得两株本土产H2S极端表型的菌株：不产菌株112y4和高产菌株32y12。利用转录组测序并结合全基因组测序等，发现硫代谢下游途径中MET17/CYS4/CYS3（编码的蛋白质同为VB6依赖酶），硫胺素（VB1）合成途径关键基因THI5家族基因以及丝氨酸合成途径关键基因SER33等与酿酒酵母产硫化氢具有显著相关性。为研究这些基因在影响酿酒酵母产硫化氢中的功能，首先通过Cre-Loxp基因操作系统构建了32y12双营养缺陷工程菌株，然后利用CRISPR-Cas9基因编辑系统成功敲除THI5家族基因（共8个同源基因），并且对硫化氢代谢下游基因MET17/CYS4/CYS3/SER33进行了过表达菌株构建。基因功能验证试验发现；（1）即使同为VB6依赖酶，MET17/CYS4/CYS3的过表达对H2S产量影响不尽相同，MET17过表达可以减少H2S产量90%以上；（2）THI5家族基因缺失菌株在正常条件下的模拟汁中发酵并没有对硫化氢表型产生影响，与预想结果不一致，需进一步研究；（3）对丝氨酸合成途径重要基因SER33梯度表达后发现，MET17/CYS4/CYS3的过表达显著增加酵母发酵过程中H2S的释放，尤其在发酵旺盛期及发酵末期，H2S产量相比于对照菌株，分别增加32-62%，182-472%，但是其不同表达水平差异未造成H2S表型的显著差异。这样的结果也预示着丝氨酸或者SER33与H2S产生关系密切。研究结果对深入理解酿酒酵母硫酸盐还原途径中H2S产生的分子机制，具有重要的科学意义，对于有效控制葡萄酒酿造过程中H2S产生，具有重要的实践意义。