协同调控甲羟戊酸下游途径强化重组酿酒酵母β-胡萝卜素合成能力的分子机制

Single gene regulation can cause the imbalance of mevalonate pathway and thus result in accumulation of intermediate metabolites, which greatly inhibit cell growth and product synthesis. Therefore, how to avoid intermediate accumulation is the key to improve isoprenoid biosynthesis when increasing the metabolic flux. In this study, based on the principle of reverse metabolic engineering,the recombinant Saccharomyces cerevisiae strains producing different levels of β-carotene were used as research object,the expressions of every enzyme in the bottom mevalonate pathway were precisely and synergistically regulated through promoter engineering to reduce the intermediates accumulation,to improve cell growth and enhance the β-carotene production, which can help to discover the molecular mechanism of bottom mevalonate pathway regulating β-carotene biosynthsis. These results are expected to elucidate the mechanism of regulating carotenoids synthesis in microorganism and deepen the understanding of mevalonate pathway regulation. This study can also provide some valuable references for research of other isoprenoids production by microorganism.

对甲羟戊酸途径单基因调控很容易引起代谢途径失衡和堵塞，导致中间代谢产物积累，最终抑制细胞生长和产物合成。因此，在整体提高代谢流基础上避免中间代谢产物积累是提高类异戊二烯产物合成水平的关键。本研究基于反向代谢工程原理，以多株合成不同水平的β-胡萝卜素重组酿酒酵母菌为研究对象，利用启动子工程技术，对甲羟戊酸下游途径各个酶的表达水平进行精确和协同调控，以降低中间代谢产物积累,改善细胞生长，进一步加强重组酿酒酵母合成β-胡萝卜素的能力，最终揭示甲羟戊酸下游途径调控β-胡萝卜素合成的分子机制。本研究对于阐明微生物调控类胡萝卜素物质合成机制，加深对甲羟戊酸途径调控机制的认识将具有重要的学术意义和应用价值。同时，研究结果还可为其它类异戊二烯产物的研究提供有益的借鉴。

外源β-胡萝卜素合成对甲羟戊酸途径关键酶表达水平和细胞生理具有显著的影响。提高了甲羟戊酸途径中HMG1, ERG8, ERG19 和 ERG20的表达水平，特别是在20 h，与原始菌相比，分别为3.16±0.12, 2.23±0.10, 3.20±0.15 和 3.77±0.13 倍。而HMG2, ERG12 和IDI没有太大的差异，参与脂肪酸合成的基因ACC1和OLE1基因表达水平大幅提高，表明色素的合成影响了脂肪酸的合成。过量表达ERG19, ERG12 和 ERG20 能够提高类胡萝卜素合成水平（11.0-32.2%），而过量表达ERG8 和 IDI1却降低色素水平（22.9% 和 13.6%），与基因提高相比，外源添加60 mg/L 油酸和棕榈油酸获得83.7% 和130.2%的色素增加幅度，同时对细胞生长的影响并不显著，表明提高胞内不饱和脂肪酸含量是提高色素合成水平的一种有效策略；.（2）低温下HMG1, ERG9, ERG19, ERG20 和 IDI1基因表达水平提高，采用低温胁迫和抑制脂肪酸合成组合的方法可以显著提高色素合成水平，复合胁迫下色素水平与单一条件（低温胁迫和抑制脂肪酸合成相比）分别提高了28.3%和18.8%；.（3）外源类胡萝卜素合成降低了前体物质乙酰辅酶A含量，从而降低脂肪酸和麦角固醇的合成水平，引起细胞膜流动性降低，导致转运蛋白活性降低，使得细胞内金属离子，氨基酸水平降低，这种生理变化不利于细胞生长和色素的合成，因此，如何改善细胞膜流动性对于提高色素水平至关重要；.（4）类胡萝卜素的合成降低了胞内各种代谢产物的水平，包括氨基酸、葡萄糖、果糖、乙酸、甘油和各种脂肪酸，特别乙酸的含量，表明外源色素合成使得中间代谢产物大量流向色素合成途径。采用延迟（10 h）外加乙酸钠（10 g/L）的方法来补充胞内乙酸含量的降低，同时显著提高类胡萝卜素的合成水平，与对照相比提高了39.3%，而胞内各种代谢产物水平都得到了不同程度的补充。.以上研究表明，过量表达甲羟戊酸途径关键酶与调控脂肪酸合成途径协同调控是一种有效提高类胡萝卜素合成水平的策略。