酿酒酵母工程化外源途径的转录精细调控基础

For the difficulty in fine transcription regulation of heterologous metabolic pathway in Saccharomyces cerevisiae, the promoter regulatory elements and their functional appilication will be investigated by using synthetic biology in this research. First, the new promoters will be discovered through studying the structures and functions of the present promoters in S. cerevisiae and a new promoter library will be constructed. Second, after the analysis of the sequences of promoters, the transcription factor binding sites (TFBSs) which are important to the function of promoters will be screened and the molecular mechanisms of the effect of TFBSs on promoters will be clarified. Then, by using these TFBSs, a series of fine tunable promoters will be constructed, in which their strengths will not be discrete but continuous. At last, a typical primary synthetic pathway of xylitol and a typical secondary synthetic pathway of β-amyrin previously reconstructed in our group will be chosen to verify the function of the promoter regulatory elements in S. cerevisiae. In this research, the flux not only in heterologous pathway but also branched pathway will be balanced through the promoter regulatory elements and the biosynthetic efficiency will be expectantly improved, which will also provide ideas for the regulation of engineered metabolic pathway.

针对外源代谢途径在酿酒酵母工程菌中转录过程难以精细调控的问题，本项目运用合成生物学方法开展酿酒酵母精细调控元件的发掘与功能应用研究。首先研究酿酒酵母启动子的结构与功能，发掘新的启动子，获得新的酿酒酵母启动子文库；其次对启动子序列进行分析，筛选出对启动子功能具有重要影响作用的转录因子结合位点，阐明转录因子结合位点对启动子特性影响的分子机制；然后以此为基础构建出启动子强度可控的启动子元件，将启动子强度的离散性转变为连续性；最后，在酿酒酵母中将精细调控启动子元件与课题组前期已构建好的初生代谢木糖醇合成途径和次生代谢β-香树脂醇合成途径进行组装，以进行启动子调控元件的功能验证。项目的实施可望通过启动子调控元件精确调控酿酒酵母中外源代谢途径或者分支代谢途径的代谢流，提高代谢转化效率，为代谢工程的途径调控研究提供思路。

启动子是最为有效的控制基因转录水平的代谢流调节工具，通过构建不同强度的启动子，并结合转录因子结合位点的改造，实现了基因不同的转录水平精细调控，是提高代谢途径目标产物合成的有效手段。. 项目围绕任务计划进行了以下工作：（1）从酿酒酵母的糖酵解途径和胺酰 tRNA 合成酶途径中克隆得到了 11 个组成 型启动子，利用 eGFP 和 LacZ 作为报告基因表征了启动子强度的多样性。 （2）对糖酵解途径启动子的序列进行分析发现了转录因子结合位点（TFBSs） 对启动子功能的影响，通过TFBSs敲除和与启动子融合实验验证了启动子 FBA1p 和 GPM1p 序列中 Rap1、 Gcr1 及 Gcr2 TFBSs对启动子功能的增强作用，不同拷贝数的 TFBSs 以及不同来源的 TFBSs 的组合对启动子强度也有影响。（3）通过克隆木聚糖降解的关键基因木聚糖酶和木糖苷酶以及木糖醇转化基因木糖还原酶，利用克隆得到的不同强度的启动子，在酿酒酵母细胞内构建了可以直接利用木聚糖转化木糖醇的代谢途径，启动子优化后将木糖醇的产量提高了 90%。（4）将光果甘草β-香树脂醇合酶基因进行密码子优化并采用质粒表达，通过异源表达白色念珠菌鲨烯单加氧酶促进鲨烯向下游2,3-氧化鲨烯的转化，然后过表达大肠杆菌IPP异构酶、酵母自身FPP合酶和鲨烯合酶增强鲨烯供应，构建了工程菌SGib，这种“推拉式”代谢策略使产量达到36.50±1.99 mg/L，提高了49倍。. 项目还开展了乙酰辅酶A前体强化合成途径改造。（1）强化了酿酒酵母内源乙酰辅酶A合成途径；（2）构建外源乙酰辅酶A合成途径；（3）敲除柠檬酸合酶以阻止细胞质乙酰辅酶A流失；（4）进行葡萄糖补料发酵。β-香树脂醇产量达到272.42mg/L，为已报道最高产量。. 筛选了互不干扰的铜离子、半乳糖等诱导型启动子，构建动态可诱导基因精细调控代谢途径。研究对高产微生物代谢途径的构建具有参考价值。