基于氧化还原电位的酿酒酵母合成中链脂肪酸乙酯的调控机制研究

Medium-chain fatty acids ethyl esters (MCFAEE) are important fragrant compounds and can bring wine elegant and lasting aroma of flowers and fruits. However, their regulation mechanism of oxidation-reduction potential (ORP) is not clear, and the regulation strategy is not perfect, which limit their perfuming efficiency. Focusing on the problem above, firstly in the simulated wine fermentation system, the response of MCFAEE synthesis to ORP in Saccharomyces cerevisiae and perfuming efficiency of MCFAEE are analyzed. Furtherly fermentation kinetics equation is established, and ORP regulation model with phenomenal characteristics is built in this project. Then, the cell samples under typical ORP conditions are analyzed to screen key functional genes, and reconstruct metabolic pathways of MCFAEE by means of metabolomics and transcriptomics. With oxidation–reduction state of cells, the metabolism of MCFAEE is analyzed under ORP regulation. Finally, the relationship between ORP transcription factors and key functional genes are examined by gene knockout, gene overexpression and RT-qPCR, and the regulation of gene transcription with ORP is analyzed. And the regulation mechanism of MCFAEE synthesis in Saccharomyces cerevisiae based on ORP is revealed. The above research is of great significance to understand MCFAEE synthesis deeply, establish its perfect regulation strategy, give full play to perfumed effectiveness of MCFAEE and improve wine aroma quality.

中链脂肪酸乙酯是重要的呈香化合物，可赋予葡萄酒优雅持久的花香和果香。但其氧化还原电位(ORP)调控机制不清晰，调控策略不完善，制约了其增香效能的提升。针对上述问题，本项目首先在模拟葡萄酒发酵体系中，分析酿酒酵母合成中链脂肪酸乙酯对ORP的响应和该响应下中链脂肪酸乙酯的增香效果，建立发酵动力学方程，构建ORP表观调控模型。然后，采用代谢组学和转录组学的方法，分析典型ORP条件下的菌体样品，筛选关键功能基因，重构中链脂肪酸乙酯代谢通路，结合细胞氧化还原状态，分析ORP调控下中链脂肪酸乙酯的代谢规律。最后，采用基因敲除、过表达和实时定量RT-qPCR等技术，检验ORP转录因子与关键功能基因的关系，分析响应ORP的基因转录调节规律，揭示基于ORP的酿酒酵母合成中链脂肪酸乙酯的调控机制。上述研究对深入理解中链脂肪酸乙酯的合成，建立其完善的调控策略，充分发挥其增香效能，提高葡萄酒香气质量具有重要意义。

中链脂肪酸乙酯(MCFAEEs)是葡萄酒重要的芳香化合物，其合成与氧化还原电位(ORP)密切相关。本项目基于ORP研究了酿酒酵母合成MCFAEEs的过程，初步解析了ORP 调控MCFAEEs合成的机制。主要内容与结果如下：1. 通过研究不同ORP条件下的酵母活菌数、糖浓度、乙醇含量和MCFAEEs含量，发现在-110 mV到60 mV区间内，ORP对酵母生长、糖代谢和乙醇生产没有显著影响。随着ORP的升高，终点样品中MCFAEEs先升高后降低，在0 mV时最高(1222.97 μg/L)。随着发酵时间的延长，MCFAEEs先升高后降低，在96 h最高，此时0 mV下MCFAEEs含量为2363.24 μg/L。基于上述工作，构建了ORP调控MCFAEEs合成的表观模型；2. 通过分析代谢流，发现碳通量主要流向乙醇生产，且不同ORP下没有显著差异。在0 mV下，三羧酸循环及其外流柠檬酸的碳通量较高，这有利于乙酰辅酶A的供应，促进MCFAEEs的合成。随着ORP升高，NADP+/NADPH升高。NADPH为脂肪酸碳链延伸提供了还原力。过高的NADP+/NADPH不利于脂肪酰合成，而NADP+/NADPH过低会导致碳链过度延伸，不利于获得中链脂肪酰。0 mV下的NADP+/NADPH处于中等水平，有利于中链脂肪酰积累。通过RT-qPCR，发现0 mV时基因ACC1、FAS1、FAA2 和EEB1表达量较高，有利于MCFAEEs合成，基因POX1表达量较低，有效缓解了MCFAEEs降解。上述工作从代谢流、辅因子和基因调控角度阐释了ORP调控的MCFAEEs代谢规律，构建了MCFAEEs代谢的ORP调控模型。3. 转录组学数据显示，与CK相比，0 mV下共有21个差异表达基因。其中，15个上调，6个下调。GO富集分析显示差异基因富集在生物过程，KEGG富集分析差异基因主要集中于代谢途径、类固醇生物合成、谷胱甘肽代谢等，0 mV下上述途径增强。4. 分子生物学试验证明转录因子HAP5与MCFAEEs合成密切相关。过表达HAP5可以提高菌株对ORP的响应，使菌株在低ORP下合成更多MCFAEEs。本项目从表观性状、代谢调控和基因转录调节等角度初步解析了基于ORP的酿酒酵母合成MCFAEEs的调控机制，为建立科学的葡萄酒酿造调控策略，充分发挥MCFAEEs的增香效能提供了理论基础。