基于PD-1/PD-L1和CD28/CD80信号通路的软肝饮对慢性乙型肝炎免疫调控作用分子机制研究

Chronic hepatitis B (CHB) is a major infectious disease our country has faced. The number of iNKT cells decreased or decreased function associated with the immune tolerance of CHB. The inhibition of PD1/PD-L1 and activation of the CD28/CD80 pathway can improve iNKT cell function, enhance the body's ability to clear the virus is a research hotspot. The preliminary study found that ruanganyin has the function of anti hepatic fibrosis and stimulate the immune function. We proposed innovative treatment of CHB immune regulation effect is to enhance the cellular immune function through inhibition of PD1/PD-L1 and activation of the CD28/CD80 pathway hypothesis. HBV transgenic mice is an ideal model for the immune mechanism of CHB. This topic uses two signaling pathway above in HBV transgenic mice as the breakthrough point through two methods in vivo and in vitro. By immunohistochemistry, flow cytometry, siRNA transfection, Western blot, QRT PCR technique to observe: 1. The pathological changes of liver;2. Peripheral blood and liver iNKT cell number and cell surface signaling pathway related factors;3. To observe the effect of ruanganyin on related factors of the two pathways. Explore the molecular mechanism of ruanganyin immune regulation effect of HBV transgenic mice from the signaling Perspective.

慢性乙型肝炎（CHB）是我国面临的重大传染病。iNKT细胞数量减少或功能降低与CHB免疫耐受相关。抑制PD1/PD-L1、活化CD28/CD80通路可提高iNKT细胞功能，增强机体清除病毒能力是研究热点。前期研究发现中药软肝饮有“抗肝纤维和激发免疫功能的作用”，故创新提出“治疗CHB免疫调节效应是通过抑制PD1/PD-L1和活化CD28/CD80通路的协同作用增强细胞免疫的假说”。HBV转基因小鼠是研究CHB免疫机制理想模型，本课题采用HBV转基因小鼠以上述两条信号通路为切入点，采用体内和体外两个研究方法，运用免疫组化、流式细胞、siRNA转染、Western Blot，qRT-PCR等技术观察：①肝脏病理变化；②外周血和肝脏iNKT细胞数量及细胞表面的信号通路中相关因子变化；③观察软肝饮对两条通路中相关因子的影响。从信号通路角度探究软肝饮对HBV转基因小鼠的免疫调控影响的分子机制。

软肝饮能够通过下调PD-1/PD-L1并促进CD28/CD80表达，从而增加iNKT细胞活性，从而提高慢性乙型肝炎免疫功能。本课题采用HBV转基因小鼠以上述两条信号通路为切入点，采用体内和体外两个研究方法，运用免疫组化、流式细胞、siRNA转染、Western Blot，qRT-PCR等技术观察，从信号通路角度探究软肝饮对HBV转基因小鼠的免疫调控影响的分子机制。首先开展动物实验研究，构建HBV 转基因小鼠模型组、正常对照组、不同浓度软肝饮HBV转基因小鼠，观察肝组织病理学及实验指标，从而发现中药软肝饮治疗慢乙肝的作用机制可能与IL-10、IL-2、IFN-γ高表达、IL-4低表达有关。其次开展动物体内实验研究，构建模型组iNKT细胞与空白对照组，通过流式细胞仪、免疫荧光法实验方法得出模型组iNKT细胞及其表面CD28、CD80均降低，而组iNKT细胞表面PD-1、PD-L1的表达水平明显增高。然后通过siRNA 转染等技术体外分离制备 HBV 转基因小鼠肝 iNKT 细胞与鉴定，发现siRNA能够分别有效降低iNKT细胞中PD-1和CD28表达。进一步通过western-blot、免疫荧光、qPCR等检测发现PD-1和CD28起到互相拮抗，具体来讲，软肝饮能够通过下调PD-1并促进CD28表达，从而增加iNKT活性，并能够调控细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的表达。综上述研究结果，本研究探讨PD-1/PD-L1和CD28/CD80信号通路的软肝饮对慢性乙型肝炎免疫调控作用分子机制研究奠定了工作基础，同时基于iNKT 细胞活化的免疫治疗 CHB 提供了一条新途径。