基于转录组学的赤霉烯酮暴露损害驴卵泡发育机制的研究

The research of mycotoxin in donkey forage is weak, which has not been introduced to the national standards. In intensive donkey farming, the excessive presence of zearalenone (ZEA) and other mycotoxins in forage had become an important factor impairing the donkey’s reproduction. This project aims to study on the transformation relationship of ZEA content between the asinine forage and follicular fluids (FF), and culture cumulus-oocyte complexes in vitro using the biotransformation of ZEA to amplify and supplement the results of donkey feeding experiment. The associated analysis of single-cell RNA-seq of oocytes or cumulus cells obtained from animal feeding and cell culture experiments would be performed. Moreover, the aim of the item is to confirm the toxic dose of ZEA in forage being harmful to donkey’s follicular development and reproduction. In addition, to explain the molecular pathways of ZEA injuring follicles development, differentially expressed genes and signaling pathways in oocytes or cumulus cells between different experiments would be proved by transvaginal oocyte retrieval (TVOR), Q-PCR and Western-blot. These results might provide a theoretical reference for the national standard of ZEA content in donkey forage, reducing the decline of breeding performance in jenny and promoting the donkey farming.

驴饲草料中霉菌毒素含量标准的研究薄弱且尚未出台国家标准。集约化养驴中，饲草料中超量存在的赤霉烯酮等霉菌毒素已成为妨害驴繁殖性能的重要因素。本项目拟结合动物饲喂试验和细胞体外培养试验，研究驴用饲草料中赤霉烯酮含量与饲喂后驴卵泡液中赤霉烯酮含量的转化关系，利用转化浓度的赤霉烯酮处理体外培养驴卵丘-卵母细胞复合体的方法放大并补充动物饲喂试验结果，同时采用穿刺取卵技术、单细胞RNA-seq技术、Q-PCR技术和Western-blot技术关联分析并验证动物饲喂试验和体外细胞培养实验中卵母细胞及卵丘细胞共有差异表达基因及信号通路，证实赤霉烯酮对驴卵泡发育的危害和饲草料中赤霉烯酮的生殖毒性剂量，阐释赤霉烯酮损害驴卵巢卵泡发育的分子途径。研究结果将为驴饲草料赤霉烯酮含量的国家标准提供理论借鉴，减少集约化饲养母驴的生产和繁殖性能下降，促进高效养驴。

为探究驴饲草料中ZEA产生生殖毒性的剂量，课题组进行饲喂试验，结果显示：ZEA处理组与对照组卵泡液和血清中的ZEA代谢物及类固醇激素浓度无显著差异；但500μg/kg及以上剂量组驴卵泡发育受到损害；且卵巢内细胞发生异常凋亡；肠道菌群结构发生改变。此外，ZEA处理驴卵丘细胞结果表明：ZEA通过ER信号通路影响卵丘细胞的分泌并导致生殖毒性，同时影响PRDX4，Caspase1和GSDMD等基因的表达进而导致细胞的炎症反应和异常凋亡现象。. 此外，课题组利用小鼠模型进行不同ZEA处理获得的驴盲肠内容物对小鼠卵泡发育影响的粪便移植试验，将饲喂试验中的驴盲肠内容物制成菌液灌胃移植给小鼠，连续处理40天。结果显示：ZEA摄入可导致驴肠道微生物结构发生变化，该变化可以通过粪便移植进行传递，并造成粪便移植后验证小鼠的卵巢内细胞凋亡数量增加、细胞抗氧化能力降低、炎症反应增强。总之，ZEA可通过改变驴肠道微生态结构的途径损害驴卵泡发育。. 为更加全面深入地探究霉菌毒素对养驴业的影响，课题组采集活驴睾丸的不同区域及附睾分别进行空间和单细胞转录组测序。结果显示：驴精子发生、成熟与储存过程中有其独特的作用方式，这与小鼠和猪的精子发生及成熟储存在显著的差异。此外，附睾的不同区域表达不同的Defb家族基因，表明免疫相关基因在精子成熟，运输与贮存过程中起着关键的作用。以上结果将为下一步申请面上项目“空间转录结合单细胞分辨率解析霉菌毒素损害驴精子发生与成熟的转录调控机制”打下基础。. 综上，课题组明确了驴肠道菌落的结构与代谢调控其繁殖机能的作用途径，构建驴的ZEA-肠-卵巢发育的作用模型，这将为制定驴饲料ZEA含量上限的国家标准打下基础，为减少集约化饲养母驴的生产和繁殖性能下降，防治ZEA损害家畜繁殖性能开辟新途径。此外，课题组依托本项目获得了纵向课题4项，横向课题1项；培养了青年教师3名，硕士研究生4人；并在山东德州建立了“山东禹城驴科技小院”，依托本项目成果进行了德州驴健康养殖技术服务与产业化推广工作。