microRNA参与炎性介质介导的内皮细胞1-磷酸鞘氨醇受体表达的调节

1-磷酸鞘氨醇（S1P）有S1PR1、2、3、4和5等5种受体，研究提示S1PR2表达的增加参与了多种炎症相关性疾病的发生和发展。本实验室已证明静息的微血管内皮细胞表达S1PR1和S1PR3蛋白，也表达S1PR2 mRNA；LPS和TNF-alpha刺激可以引起内皮细胞S1PR2的mRNA和蛋白表达增加；S1PR2拮抗剂减轻LPS和TNF-alpha导致的内皮细胞单层通透性升高。本研究拟采用miRNA芯片、实时定量PCR等技术，观察LPS和TNF-alpha刺激内皮细胞后miRNA表达谱的变化，据结果选择内皮细胞特定的miRNA如miR-130a等，通过外源性转染其模拟物或抑制物，证明这些miRNAs活性的改变能够介导S1PR2表达的变化；并证明LPS和TNF-lpha通过影响miR-130a等的转录，解除S1PR2的基因表达抑制，使S1PR2表达水平增加，并介导进一步的炎性反应。

本项目的主要目的是明确 LPS和 TNF-alpha是否可以调节 miR130a等在内皮细胞中的表达，即TNF-alpha或LPS可下调 microRNA如 miR-130的表达，进而解除 microRNA对S1PR2基因转录和蛋白表达的抑制，影响内皮功能。.采用miRNA芯片技术初步筛选和荧光定量PCR验证，观察了TNF-alpha刺激脐静脉内皮细胞后表达下调的miRNA类型。结果提示，miR-130a的表达确有变化，且有时间变化特点，刺激后3-6 hmiR-130a有明显降低，12 h后升高，24 h则再次降低；对应于这个miR-130a的12h和24 h变化的时间特点，S1PR2的mRNA在TNF-α刺激后12 h和24 h的表达都明显增加，但蛋白表达只有在24 h后才增加。通过合成miR-130a的模拟物和抑制物，进一步用miR-130a 模拟物或抑制物转染细胞48 h，观察内皮细胞S1PR2的mRNA和蛋白表达的变化。用miR-130a抑制物载体转染细胞后，S1PR2的mRNA含量明显增加，且S1PR2的蛋白表达也明显增加；结果直接证实了miR-130a对S1PR2的mRNA的抑制作用。.本项目初步研究结果基本证实了原来的假设，即以miR-130a为代表，miRNA参与炎症介质介导的内皮细胞1-磷酸鞘氨醇受体2表达的调节。本课题还对LPS刺激后内皮细胞S1PR2的表达进行了探讨，结果尚在整理中，今后将继续探讨TNF-α刺激内皮细胞早期（3-6 h）后S1PR2的mRNA和蛋白表达变化，并争取进一步申报国家基金面上项目。