ERM蛋白在血管新生和糖尿病微血管病中的作用

It is proposed that advanced glycation end products (AGEs) is involved in the development of diabetic angiogenesis by inducing the threonine phosphorylation of erzin, radixin, and moesin (ERM proteins). The phosphorylation of ERM will mediates the formation of endothelial tip cells, and the migration, proliferation, and tubulogenesis of endothelial cells, leading to the pathological angiogenesis. Using timelapse technique of confocal microscope and other cellular and molecular biological methods such as siRNA and mutant constructs, this proposal focuses on exploring the effects of ERM protein on AGE-induced angiogenesis by observing the formation of endothelial tip cells, and the migration, proliferation, and tubulogenesis of endothelial cells. The in vivo animal model will be used to validate the effects of ERM on cellular level. This proposal aims to elucidate the involvement of ERM protein in the progress of angiogenesis and the mechanism of AGE-induced diabetic proliferative microangiopathy.

本项目假设ERM蛋白的苏氨酸磷酸化可以激活内皮细胞，促进tip cells的形成，加速内皮细胞的迁移、增殖和毛细血管成管，促进血管新生，导致血管新生的发生发展。本研究将借助免疫细胞化学等技术，利用siRNA、构建激活型或抑制型突变体等方法，通过观察视网膜内皮细胞的尖细胞形成、迁移、增殖和成管等指标，探讨ERM蛋白在血管新生过程中的作用；并观察晚期糖基化终产物（AGE）干预对血管新生过程的影响及其ERM蛋白在其中的作用，以探讨糖尿病增生性视网膜病的发病机制；鉴于血管新生不足导致的糖尿病皮肤损伤修复障碍可能是糖尿病足发病的原因，本研究还将以皮肤微血管内皮细胞为另一研究对象，观察两种组织的内皮细胞在相同刺激条件下的激活、迁移和增殖并进行比较，进一步阐明ERM在其中的作用，并在组织和整体水平验证。旨在揭示ERM蛋白对血管新生的影响，探讨糖尿病增生性血管病发病的下游分子机制，为临床诊治提供新的思路。

项目背景：血管过度新生是糖尿病增生性视网膜病的重要病理过程，晚期糖基化终产物（AGEs）可能在其中发挥重要作用。本研究旨在探讨AGEs介导血管新生的发生机制。.研究内容：本研究以内皮细胞（HUVECs）、动脉环以及整体动物为研究对象，探讨ERM蛋白家族中的膜突蛋白（moesin）是否参与内皮细胞血管新生的过程及其在AGEs介导的内皮细胞血管新生中的作用和机制。.重要结果：本研究首先证明AGEs可剂量依赖性地促进内皮细胞的增殖、极化、迁移和成管；下调moesin的表达能抑制AGEs对内皮细胞的增殖、极化、迁移和成管的促进作用；AGEs促进moesin磷酸化增高，下调moesin的表达能抑制AGEs对内皮细胞的促moesin磷酸化水平，moesinT558位点磷酸化突变可影响AGEs介导的内皮细胞moesin磷酸化水平；而moesinT558位点的抑制型突变可抑制AGEs对内皮细胞的增殖、极化、迁移和成管的促进作用；moesinT558位点的激活型突变本身即可促进内皮细胞的增殖、极化、迁移和成管；RhoA活性的变化对内皮细胞磷酸化moesin水平有影响，RhoA-ROCK通路的激活可介导moesin磷酸化，而下调RhoA-ROCK通路活性和moesin磷酸化水平后，AGEs对内皮细胞的增殖、极化、迁移和成管的促进作用也被抑制。在组织学和动物整体水平，发现与对照组相比，AGEs刺激下AGEs和阳性对照VEGF刺激组新生血管数量明显增多，血管内皮细胞排列紊乱，血管周围细胞覆盖率下降；可见AGs处理小鼠视网膜的新生血管明显增多，在整体证明AGEs具有促进血管新生的作用。制备了moesin敲基因小鼠，将进一步在整体证明moesin及其磷酸化在血管新生发生中的作用及其对AGEs介导的血管过度新生的影响。.关键数据：获得了AGEs刺激影响HUVECs增殖、极化、迁移和成管的数据，获得了AGEs影响主动脉环血管新生的数据，获得了AGEs介导小鼠血管新生的数据；也获得了moesin及其磷酸化水平影响AGEs介导血管新生的数据。 .研究结论： moesinT558位点的磷酸化激活参与内皮细胞血管新生；AGEs通过激活RhoA/ROCK通路介导moesin磷酸化，导致血管新生。.科学意义：本研究从AGEs介导moesin磷酸化的角度，部分阐明了糖尿病性增生性微血管病变的发生机制。