肝细胞核因子4ɑ对肝细胞DNA损伤修复途径的影响

前期研究发现肝细胞核因子4α（HNF4α）可抑制基因毒物- - 亚硝基二乙胺（DEN）诱发大鼠肝细胞癌，推测HNF4α可能参与调控DEN诱导的肝细胞DNA损伤修复过程。据此本课题设计研究HNF 4α上调对亚硝基二乙胺诱导的肝细胞DNA损伤修复及增殖、凋亡的影响，分析此过程中DNA损伤修复、调亡相关信号蛋白（γ-H2AX、 p53、Caspase-8、Caspase-9、ATM、ATR、Fancd2、BRCA1、BRCA2、Rad51、 DNA-PKcs、Ku70、XRCC4等）表达变化，并采用SiRNA基因沉默技术及基因敲出小鼠模型研究BRCA2介导的同源重组途径及Ku70介导的非同源末端连接途径在HNF4α诱导肝癌细胞分化及抑制小鼠肝癌发生中的作用。目的在于明确HNF 4α与肝细胞DNA损伤修复调控的相关性，进一步揭示HNF 4α诱导肝癌细胞分化及抑制肝癌发生的分子机制。

前期研究发现肝细胞核因子4α（HNF4α）可抑制亚硝基二乙胺（DEN）诱发的大鼠肝细胞癌，据此课题组推测HNF4α可能参与调控DEN诱导的肝细胞DNA损伤修复，为此进行了以下研究：. 1．在细胞学水平，采用不同肝癌细胞株及大鼠原代肝细胞研究了DEN处理不同时间、不同剂量γ-H2AX和 H2AX表达，可见γ-H2AX表达随时间延长及药物浓度增高而增加，提示DEN诱发肝细胞DNA损伤有时间、剂量效应。AdHNF4α感染大鼠原代肝细胞，上调HNF4α基因表达，发现上调HNF4α基因可减弱DEN诱发的大鼠原代肝细胞γ-H2AX表达。染色体分析、单细胞凝胶电泳试验均显示上调HNF4α组较对照组DEN诱发的大鼠原代肝细胞DNA损伤减弱。Realtime-PCR发现上调HNF4α可诱导DEN处理后细胞ATM、Fancd2、BRCA2等mRNA表达增强，Rad51、Ku70等mRNA表达减弱。. 克隆BRCA2 siRNA，转染大鼠肝细胞株BRL获得BRCA2沉默型肝细胞株。用DEN处理AdHNF4α及AdGPT感染的BRCA2沉默型/表达型肝细胞1小时后，除出DEN，再培养12小时使DNA损伤修复。Western Boltting发现DEN处理后BRCA2表达型肝细胞γ-H2AX表达增强；除出DEN，再培养12小时，γ-H2AX表达会明显减低；BRCA2沉默型肝细胞DEN处理后再培养12小时γ-H2AX表达不会减少；有意义的是上调HNF4α的BRCA2沉默型肝细胞DEN处理后再培养12小时γ-H2AX表达也同样不会减少，提示HNF4α对DNA损伤修复的调控作用可能与BRCA2信号通路相关。. 2．使用DEN获得大鼠肝癌模型，免疫组化显示造模组与正常对照相比，γ-H2AX表达明显升高，且随时间的延长有累积，显示DEN造模过程中大鼠肝细胞存在DNA损伤且随时间累积。腹腔注射AdHNF4α上调模型大鼠肝HNF4α表达（治疗组），Realtime观察发现治疗组与对照组相比γ-H2AX各时间点表达明显减弱，且发现治疗组与对照组相比大鼠肝脏细胞ATM 、BRCA2等 mRNA表达增高，Rad51 mRNA表达降低。. 本研究证实HNF4α参与调控DEN诱导的肝细胞DNA损伤修复，可能与激活ATM- BRCA2途径相关。