基于光谱监测的多频超声强化蛋白酶膜耦合反应机制研究

The operations of direct sampling of the mixture and off-line spectral detection after centrifugation, for protein and protease with complex structures, are difficult to accurately reflect the real chemical reaction process. This project using the latest international technology of the enzymolysis and membrane separation coupling reaction strengthened by multi-frequency ultrasound based on on-line spectral detection, were aimed to 1) reveal the molecular mechanism of structure and biological activity changes of protein, protease, and product, 2) find the chemical reaction path of protein cracking to peptide, and 3) investigate the working mechanism of multi-frequency ultrasound used in protein enzymolysis and membrane separation coupling reaction from the molecular level. This study has epochal value for building an intelligent on-line spectral detection system of multi-frequency ultrasonic assisted enzymolysis and membrane separation coupling reaction. This project can also be applied in biology, medicine and other fields, to physical field enhancement and on-line spectral monitoring of the biological and biochemical reaction processes. Therefore, this proposal has extensive application value.

酶解反应常用的“混合液直接采样、离线离心后光谱检测”，对于具有复杂结构的蛋白质、蛋白酶而言，难以准确监控真实的化学反应过程。本项目利用国际上最新的“多频超声波强化酶膜耦合反应的在线光谱监测”技术，揭示蛋白质、蛋白酶和产物的结构和生物活性变化的分子机制，以及蛋白质酶解生成肽的降解路径，从分子水平上揭示多频超声改变蛋白质酶膜耦合反应的机理，对于建立一个多频超声强化蛋白质酶膜耦合反应的智能在线光谱控制系统具有划时代的价值。本项目建立的技术方法同样可以应用于生物、医药等领域中的生物反应、生化反应过程的物理场强化与在线光谱监控研究，具有广泛的应用价值。

传统蛋白酶解存在蛋白转化率低、产物得率低，以及生产中离线分离、脱线检测造成的数据失真和不够准确等问题，本项目利用“在线膜分离+多频超声波强化+在线光谱监测”融合技术攻克了上述问题。针对多频超声波强化酶膜耦合反应的在线光谱监控系统进行了详细的研究；揭示了多频超声改变蛋白质、蛋白酶和产物的结构和生物活性的分子机制；研究了蛋白质酶解生成肽的特点。全面完成了研究任务，主要研究结论：创新研发了20/28 kHz超声辅助梯度稀释补酶膜耦合制备新技术，实现了活性肽的连续化生产，得率和活性达到最大68.1%和86.1%，与传统的未超声处理和脱线膜分离模式相比，得率提高了58.7%；多频超声波通过改变蛋白质、蛋白酶和产物的结构等提高了酶解敏感性，从而提高了产物产量；此外，构建了基于1stDer-SiPLS模型的光纤式近红外光谱在线监控系统，研究发现可以通过监控蛋白质水解度、蛋白酶α-螺旋含量、产物活性和产量的波段实现对系统的优化与智能化控制，为多频超声强化蛋白质酶膜耦合反应的智能在线光谱控制系统的开发提供了理论基础和技术支撑；研发的新肽主要是由8-14个氨基酸组成，经PeptideRanker数据库预测这些肽具有良好的生物活性，具有广泛的应用价值，可以推动保健品等行业的快速发展。主要成果：发表加课题编号的SCI论文11篇，其中JCR 1区8篇。申请发明专利4件，其中授权国家发明专利1件。核心成果“蛋白质超声强化智能加工及酶膜耦合反应技术装备创制与应用”通过了中国轻工业联合会的鉴定[2021第081号]。核心成果“高效智能化酶解制备植物源活性多肽关键技术研发及其应用”获得2020 年度中国食品科学技术学会科技创新奖-技术进步二等奖。相关技术和装备已经应用于6家企业，取得了良好的社会和经济效益。主办“金山食品物理加工论坛”5次，其中国际会议2次；成立“食品物理加工国际联合研究中心”1个。