多频超声促进蛋白质酶解反应及机制研究

The protein enzymolysis reaction promoted by multi-frequency ultrasound and its mechanism were studied in this project. Compared with the mono-frequency ultrasound processing and the processing without ultrasound, the enzymolysis performance under the multi-frequency ultrasound processing was systematically evaluated. The work mode and main parameters of multi-frequency ultrasound processing were further optimized. Moreover, the reaction kinetic and thermodynamic models of enzymolysis under the multi-frequency ultrasound processing were established. The internal relations between the spectral characteristics and architectural features of protein and protease and the enzymolysis reaction promoted by multi-frequency ultrasound were discussed. From the chemical reaction dynamics and molecular level, this research illuminated the protein enzymolysis reaction mechanism promoted by multi-frequency ultrasound and developed corresponding control mechanism. The proposals of this project were to resolve the development bottlenecks of traditional enzymolysis technology for functional polypeptides preparation from protein, promote the development of new ultrasonic technology from conventional work mode to advanced one, and push the deep-processing field in agricultural products and food and the health industry forward.

本项目研究了多频超声波处理促进蛋白质酶解反应的机理及控制机制。与单频超声处理、未经超声处理比较，本研究重点评价多频超声处理的酶解效果，优化多频超声处理的工作模式和主要参数；建立基于多频超声波处理的酶解反应动力学和热力学模型；探讨蛋白质和蛋白酶波谱特性、结构特征改变与多频超声波处理促进酶解反应之间的内在关联；从化学反应动态学和分子水平两个层面阐明多频超声波处理促进蛋白质酶解反应的机理，建立多频超声促进蛋白质酶解反应的控制机制。该项目不仅可以突破传统蛋白质酶解制备功能性多肽技术的发展瓶颈，而且可以推进超声波新技术从常规工作模式到高级工作模式的发展，也将进一步推动农产品与食品精深加工领域及健康产业的发展。

项目研究了多频超声波处理促进蛋白质酶解反应的机理及控制机制。与单频超声处理、未经超声处理比较，本研究重点建立了一种海藻酸钠固定化碱性蛋白酶制备方法和一种多频超声辅助玉米蛋白固定化酶解方法。制备的固定化酶具有良好的操作稳定性、热力学稳定性和重复利用率。建立的多频超声辅助玉米蛋白固定化酶解方法，与单频超声处理、未经超声处理方法相比，玉米蛋白水解度、多肽浓度、产物ACE抑制率显著提高；疏水性氨基酸，其中Met、Val和Ile含量显著增加；产物中分子量在200~1000Da高活性多肽的比例显著增大，占到62%。由此得出，多频超声处理更有利于中分子量段高活性多肽的生产。本研究优化获得了多频超声辅助玉米蛋白固定化酶解的最优工艺条件。建立了基于多频超声波处理的酶解反应动力学模型和热力学模型，多频超声处理提高反应速率V0 23%~43%，提高酶与底物亲和力KM 27%，降低活化能Ea 17%，减少活化焓ΔH 15%，减少活化熵ΔS 24%~32%，可以提高反应速率，降低反应热耗，从而提高酶解效率。探讨了蛋白质和蛋白酶波谱特性、微观结构特征改变与多频超声处理促进酶解反应之间的内在关联。多频超声处理后蛋白紫外、荧光光谱、表面疏水性和巯基含量增加，二硫键含量下降，β-折叠和β-转角含量增加，α-螺旋和无规则卷曲含量减少，微观结构变得更加疏松，纳米颗粒尺寸减小。多频超声处理后固定化酶分子结构更加有序，固定化酶的表面积增大。总体表明多频超声处理引起了蛋白质和蛋白酶分子结构、微观结构的改变，更利于底物蛋白与酶的结合，从而提高酶解效率。研究从化学反应动态学和底物蛋白、蛋白酶分子水平两个层面阐明了多频超声波处理促进蛋白质酶解反应的机理。该项目不仅可以突破传统蛋白质酶解制备功能性多肽技术的发展瓶颈，而且可以推进超声波新技术从常规工作模式到高级工作模式的发展，也将进一步推动农产品与食品精深加工领域及健康产业的发展。