基于原位实时光谱技术的扫频超声促进蛋白酶解反应分子机制研究

In recent years, research on the effect of ultrasonic on the protein structure characteristics has become a hot topic in the protein field. But to the past research on the sonochemical effect under ultrasonic promoting proteolysis reaction, domestic and foreign scholars all used the method of "time-sharing sampling then off-line analysis". The enzymatic reaction is a very complex process. If the sample is removed from the reaction sites, problems on process lag and state distortion will appear, seriously affecting the scientific judgment on the true process. For the two process on "ultrasonic pretreatment of protein before enzymatic hydrolysis" and "the enzymatic hydrolysis reaction in ultrasonic field"in this project, the international latest "micro spectroscopy + optical fiber sensing + process computing" technology and the recent developmental triple-frequency sweeping-frequency mode ultrasound equipment by applicant will be used to in-situ real-time monitor change of key indicators, such as protein molecular spectral absorption characteristics, protein surface microstructure, reaction kinetics, thermodynamics parameters and so on, for re-understanding chemical effect of ultrasound promoting the enzymatic hydrolysis reaction of protein, and more accurately revealing the molecular mechanisms in ultrasound enhancing the reaction. Method established in this project can also be used in study on other biochemical reaction process in more fields, and research result has potential application value in development of intelligent control system for hydrolysis reaction of protein.

近年来，关于超声波对蛋白质结构特性影响的研究成为蛋白研究领域的一个热点。但是过去对于超声波促进蛋白酶解反应发生声化学效应的研究，国内外学者均采用"分时采样、离线分析"的方法。酶解反应是一个极其复杂的过程，样品离开反应发生的原位，存在过程滞后和状态失真问题，严重影响着对真实过程的科学判断。本项目针对"酶解前蛋白质的超声预处理"和"在超声场中实施酶解反应"这两种过程，利用国际上最新的"微型光谱+光纤传感+过程计算"技术及申请者近期开发的三频扫频模式超声设备，对蛋白质分子光谱吸收特性、表面微观结构、反应动力学特性、反应热力学参数等关键特征指标的变化过程，进行原位实时监测研究，重新认识超声促进蛋白酶解反应发生的化学效应，更为精确地揭示超声促进反应发生的分子机制。本项目建立的方法同样可以应用于更多领域其它生化反应过程的研究，研究成果在蛋白酶解反应智能控制系统的开发中有潜在的应用价值。

超声波辅助酶解反应是食品生物制造的重要内容，但是传统的对反应过程的研究均采取的是“分时采样、离线分析”方法，存在着过程滞后和状态失真等问题；传统化学分析的方法还存在着无法实现反应过程动态监控的缺陷。.本项目以小麦谷朊蛋白质、玉米蛋白、大米蛋白为原料，以多肽制备为例，利用先进的微型光谱光纤传感技术，开展了超声促进蛋白酶解反应分子机制的研究工作。主要内容包括：（1）以水解度DH和酶解产物的ACE抑制率为指标，研究了多模式超声波预处理对蛋白酶解特性的影响，旨在获取超声波最佳工作模式和预处理参数；（2）利用原子力显微镜、红外光谱等技术手段，研究了超声波频率、功率密度和预处理时间对底物蛋白表面微观结构、纳米力学特性、分子结构的影响；（3）通过皮尔森相关性分析、主成分分析、逐步多元线性回归分析等方法，研究了超声预处理过程中底物蛋白结构表征与酶解产物ACE抑制率的关系；（4）建立了蛋白超声波预处理过程的原位实时光谱监测系统和光谱采集方法，构建了通过近红外/拉曼光谱信息预测蛋白结构特征指标变化的Si-PLS回归模型。（5）建立了蛋白酶解过程的原位实时光谱监测系统和光谱采集方法，构建了通过近红外/拉曼光谱信息预测蛋白DH、酶解液多肽浓度和ACE抑制率的Si-PLS回归模型。.取得的重要结果如下：（1）利用先进的微型光谱光纤传感技术，在硬件上建立了一个蛋白酶解反应过程基于蛋白质结构变化的主要信息原位实时检测系统；（2）建立了超声预处理过程中底物蛋白结构表征与酶解产物ACE抑制率的关系，筛选出影响酶解产物ACE抑制率最关键的蛋白结构特征指标；（3）建立了通过近红外和拉曼光谱信息预测蛋白结构特征指标、蛋白水解度、酶解液多肽浓度和ACE抑制率变化的Si-PLS回归模型。.上述研究成果，对于实时获得蛋白酶解反应的主要信息，精确揭示超声波强化酶解反应的机理，指导蛋白酶解反应智能控制系统的开发有重要的意义。