超声强化凝胶固定化蛋白酶催化特性的机制

One of the hot-spot topics in the study and industrial application of the immobilized enzyme is to enhance its relatively lower enzymatic activity compared to the mobilized enzyme. Based on the preliminary data, the project study papain,and technologies such as microstructure analysis, macro-molecular interaction analysis are used in combination with the methods from enzyme kinetics, chemical kinetics,diffusion kinetics and adsorption kinetics. This research project reveal the mechanisms of ultrasonic effects on enzymatic characters by investigating the ultrasonic effects on the structure of immobilized protease. According to the alginate, chitosan and glutin gel structure change under ultrasonic treatments, the mechanisms of ultrasonic effects on diffusion in these gel are consolidated. Based on the effects of these gel composition and structure change on the interactions between the gel and the protease molecules, we investigate how macromolecules, such as alginate, chitosan and glutin, affect on the enzymatic activities of the papain. This research project shed lights in elucidating the mechanisms of ultrasonic enhancement of enzymatic activities in these gel immobilized enzymes. The theoretical analysis is crucial for future applications in the better designs of industrial immobilized enzyme reactor，biological functional membrane，and enzyme electrode for decreased costs but increased efficiencies, and rich enzymology theory.

解决固定化酶催化能力低于游离酶问题，是实现固定化酶技术工业应用的基础和固定化酶研究热点之一。前期研究发现超声改善了海藻酸凝胶固定化木瓜蛋白酶酶学特性，证明超声具有强化其催化能力的作用。本项目基于该实际现象，采用微观结构分析、大分子间作用分析等技术手段和酶学动力学、化学动力学、扩散动力学和吸附动力学等研究方法，以木瓜蛋白酶为对象，从揭示超声改变凝胶固定化蛋白酶结构入手，确定超声影响酶学性质的特征；在研究超声改变海藻酸、壳聚糖和明胶凝胶结构的基础上，明确超声与凝胶传质扩散的关系；在研究凝胶组成、性质和结构变化影响凝胶与蛋白酶相互作用的基础上，考察海藻酸、壳聚糖和明胶等生物大分子对超声改变固定化蛋白酶催化特性的影响；本项目可望阐明超声强化凝胶固定化酶催化特性的机制，为低成本、性能更优异的工业化固定化酶反应器、生物功能膜及酶电极的设计等固定化酶的重要应用提供理论依据，并丰富酶学理论。

提高固定化酶催化能力是实现其技术工业应用的基础，为目前固定化酶研究热点之一。本项目采用微观结构分析、大分子间作用分析等技术手段及酶学动力学、化学动力学和扩散动力学等研究方法，以木瓜蛋白酶为对象，研究海藻酸钠、壳聚糖、改性明胶、海藻酸钠-壳聚糖、海藻酸钠-改性明胶等最佳包埋条件，提高固定化蛋白酶表观酶活最佳超声条件。发现超声不会改变固定化酶最适酶促反应条件，可以改变水解产物的肽链数和酶切位点数，不同超声条件、不同凝胶包埋导致固定化木瓜蛋白酶水解产物分子量分布、酶切位点存在一定的差异，高频超声趋于增加肽段数量和减少酶切位点数。与游离木瓜蛋白酶相比，固定化后木瓜蛋白酶不仅会丢失原有酶切位点，且新增酶切位点，超声有利于固定化木瓜蛋白酶恢复游离木瓜蛋白酶的原有酶切位点。超声可以避免高浓度底物抑制现象和提高酶促反应的最大反应速率νmax（6.76%~978.45%）；其在超声场中化学动力学特性符合一级反应动力学规律，超声可降低表观活化能Ea（-0.81%~-96.73%）。超声预处理、超声强化扩散过程两种超声处理方式都可大幅度提高扩散系数De（28.42%~2946.40%）。确定比表面积可以较好反映凝胶结构变化,发现超声可以改变凝胶结构与不同超声处理条件对扩散系数的影响相一致。超声可以改变多糖分子结构、电荷和疏水性，超声处理的多糖主要增加了酶分子表面疏水性和自由巯基的含量，使部分结构解折叠和分子间相互作用增强，最终改善木瓜蛋白酶的活力；超声也可改变被包埋的木瓜蛋白酶结构，表现为在活性位点的微环境中运动受限；超声条件下酶在固定化酶球表面分布更多、更密集。超声也可以改变底物结构。这些都导致固定化蛋白酶酶学性质变化。本项目成果证实了人们存在已久的有关推测，丰富了对超声效应对酶及其固定化介质影响的认识和酶学理论，为凝胶包埋法固定化酶的研究、设计、制造、后处理技术、提高酶促反应技术，以及固定化酶反应器、酶电极等固定化酶的重要应用提供理论依据，具有良好的应用前景。