CSM4B骨骼肌前体细胞移植治疗失神经骨骼肌萎缩

失神经支配的骨骼肌出现的不可逆性萎缩一直是手外科领域的难题。根据细胞移植和骨骼肌卫星细胞的研究进展，本课题拟用荧光激活细胞分选法，免疫组化，细胞移植和电生理等方法，首先完成GFP转基因大鼠CSM4B（ CD45-Sca_1-Mac_1-CXCR4+β1_integrin+）细胞的分离、纯化,将高度纯化的CSM4B细胞移植入失神经肌萎缩的大鼠体内，观察对受体大鼠体内骨骼肌细胞、肌卫星细胞的影响，骨骼肌组织学变化，并初步研究神经支配对CSM4B细胞移植的影响。为细胞移植治疗失神经骨骼肌萎缩，最终为解决手内在肌萎缩提供可能的方法。并且通过比较正常肌组织和萎缩肌组织中肌卫星细胞的分子调控和基因表达，来初步探讨失神经肌萎缩时肌卫星细胞库耗竭的可能机制。

项目完成情况：.第一部分：大鼠肌卫星细胞的体外培养与鉴定.以成年Wistar大鼠后肢肌为取材组织，采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶，以“两步法”消化分离肌卫星细胞，并采用差速贴壁法纯化。观察体外培养的肌卫星细胞增殖、分化及融合形成肌管的状态。采用免疫荧光技术,对静止和激活的肌卫星细胞分别选择其特征性标志物PAX7和MyoD为标志，对分化肌细胞选择肌细胞骨架蛋白Desmin和α-SCA为标志，分别进行细胞鉴定。.第二部分：肌卫星细胞移植与体内分化的观察.体外培养的肌卫星细胞经纯度鉴定之后，以带e-GFP基因的腺病毒转染示踪，并移植至失去胫神经支配之腓肠肌。分别在移植之后1周、2周、4周取材腓肠肌组织，制作连续冰冻切片。荧光显微镜下观察，带GFP绿色荧光的移植细胞存活、分化及形成肌管的状态。.第三部分：肌卫星细胞移植延缓失神经肌萎的疗效观察.选取成年Wistar大鼠24只，于右后肢切断胫神经，建立失神经肌萎模型。将其随机分为两组，其中12只Wistar大鼠于右侧腓肠肌注射肌卫星细胞悬液（移植组），另外12只仅注射细胞培养液(对照组)。移植4周后，选取移植组与对照组各6只大鼠，取材双侧腓肠肌，称肌湿重后，制作石蜡切片，行HE染色与Masson染色，比较肌纤维平均截面积与胶原纤维增生状态。剩余大鼠取材右侧腓肠肌，制作冰冻切片，行ATP酶组织化学染色,比较移植组和对照组肌组织中ATP酶的含量。.研究结果显示：.采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶联合消化，并用差速贴壁法纯化的方法，可在体外获得高纯度的大鼠肌卫星细胞。体外培养的大鼠肌卫星细胞可在合适条件下分化，并相互融合形成肌管。培养所得细胞在分化前表达静止期肌卫星细胞特征性标志物Pax7，在激活后表达MyoD,在分化后表达肌细胞特有骨架蛋白Desmin(结蛋白)和α-SCA(α横纹肌肌动蛋白)。外源性肌卫星细胞移植后，可在肌组织内存活、分化、相互融合形成肌管。肌卫星细胞移植组的腓肠肌，在肌湿重、肌纤维平均截面积、胶原纤维增生及ATP酶改变各方面，均较对照组有改善，其差异具有统计学意义。.可以得出结论：通过分离消化大鼠肌组织，可在体外获得高纯度的具有成肌能力的肌卫星细胞。将肌卫星细胞移植于失神经支配的骨骼肌，能够发挥延缓肌肉萎缩的作用。