推拿手法联合骨髓间充质干细胞移植延缓失神经骨骼肌萎缩的机制研究

The prevention and treatment of skeletal muscle denervation atrophy after peripheral nerve injury is a worldwide problem. Previous studies indicated that bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) can differentiate into neuron like structures and secrete various neurotrophic factors and anti-inflammatory cytokines, which play an important role in delaying the atrophy of denervated skeletal muscle. Traditional Chinese massage can promote the skeletal muscle satellite cell proliferation, increase the activity of acetylcholine, and slow down the motor endplate degeneration, delaying denervated skeletal muscle atrophy, and has been widely applied in clinical practice. However, relying on a single method is producing only limited effects on stopping denervated skeletal muscle atrophy. In this study, traditional Chinese massage is practiced in combination with BMSCs transplantation, while behavioral, morphological and electrophysiological methods are employed to study the effects of massage combined with BMSCs transplantation on denervated skeletal muscle atrophy. Enzyme histochemical and molecular biological methods are also used to study the relationship between Pax7 gene and muscle satellite cells, with the purpose of exploring the mechanism and providing a theoretical basis for the clinical application of massage combined with BMSCs transplantation for the prevention and treatment of skeletal muscle atrophy.

周围神经损伤后骨骼肌失神经萎缩的防治是世界性难题。研究表明，骨髓间充质干细胞（BMSCs）能分化成神经元样结构、分泌多种神经营养因子及抗炎细胞因子，有一定延缓失神经骨骼肌萎缩的作用，但不能防止肌肉粘连和关节僵硬。中医推拿手法可以促进失神经骨骼肌卫星细胞分裂增殖，增强乙酰胆碱酶活性，减缓运动终板退变，延缓失神经骨骼肌萎缩，并能够有效防止失神经肌肉粘连和关节僵硬，已广泛应用于临床，但单一方法防治失神经骨骼肌萎缩的作用均有限。本研究通过推拿手法与BMSCs移植联合应用，利用行为学、形态学和电生理等方法，研究推拿手法联合BMSCs移植对防治失神经骨骼肌萎缩及促进肢体功能恢复的影响，并通过酶组织化学和分子生物学方法研究Pax7基因与肌卫星细胞之间的关系，探讨推拿手法与BMSCs移植联合应用在防治失神经骨骼肌萎缩中的机制，为推拿手法联合BMSCs移植防治失神经骨骼肌萎缩的临床应用提供理论依据。

目的：通过推拿手法与BMSCs移植联合应用，利用行为学、形态学和电生理等方法，研究推拿手法联合BMSCs移植对防治失神经骨骼肌萎缩及促进肢体功能恢复的影响，并通过酶组织化学和分子生物学方法研究Pax7基因与肌卫星细胞之间的关系，探讨推拿手法与BMSCs移植联合应用在防治失神经骨骼肌萎缩中的机制。方法：2月龄雄性SD大鼠160只，180-200g，制作坐骨神经外模缝合模型，按体重大小区组随机分为五大组：BMSCs移植组、手法干预组、BMSCs移植+手法干预组、模型观察组和正常对照组。干预方法为骨髓间充质干细胞移植和推拿手法。造模成功后2、4、8、12周分别作组织病理学、运动功能学及酶组织化学检测，肌湿重比、肌卫星细胞、MyoD等各项指标检测，进行数据统计分析。结果：推拿干预组第8W和12W肌卫星细胞计数均数高于2W、4W，说明神经修复后期，推拿干预能显著促进肌卫星细胞分裂增殖；BMSCs移植组第12W肌卫星细胞计数均数与4W相同，要高于2W，低于8W。联合治疗组4个不同干预时长肌卫星细胞计数不同，12W肌卫星细胞计数均数高于2W、4W，低于8W。联合治疗组Pax7 mRNA表达随着时间推移逐渐增加，并高于推拿干预组和BMSCs移植组，一直保持较高水平。神经损伤修复后，各组肌卫星细胞计数增加，于第8周达到高峰，之后出现下降趋势，联合治疗组在神经修复后期，可维持肌卫星细胞计数于较高水平。随着时间推移，各组大鼠NCV和SFI逐渐恢复，联合治疗组大鼠的下肢功能恢复较快。结论：大鼠神经缝合后，推拿干预和BMSCs 移植联合治疗促进了肌卫星细胞分裂增殖，减缓失神经骨骼肌萎缩，可能是推拿干预促进失神经骨骼肌微循环重建，使肌肉供血量增加，一定程度上延缓了失神经骨骼肌萎缩；BMSCs 移植调节IGF-I、MyoD表达，促进肌卫星细胞分裂增殖，并向有功能的成熟肌纤维转化。另外，Pax7调节肌卫星细胞回归静止状态进行自我更新及储备再生能力。