脂肪干细胞来源的神经前体细胞移植治疗脑出血及其机制研究

There hasn't been any curative and effective method for intracerebral hemorrhage (ICH). Adipose-derived stem cells (ADSCs) can be differentiated into neural precursor cells (NPCs) in vitro under a particular condition. NPCs have the abilities of multidifferentiation and neuron reborn. Moreover, ADSCs derived NPCs are easily available, can be used in autotransplantation, and have no immunological rejection or ethical considerations. In this project, rat ADSCs, infected by a lentivral vector-encoding green fluorescent protein (GFP), will be induced to differentiate into NPCs in vitro. Then these NPCs will be transplanted into the lateral ventricle of ICH model rats using stereotactic injection. The improvement of neurological function of rats will be compared. The survival, proliferation, migration and differentiation of transplanted cells will be traced by the micro-optical sectioning tomography (MOST) system. The involving mechanisms will be investigated, which may be related to lightening inflammatory response at the early stage, reducing neuronal cell death, exogenous neurogenesis and synapse formation, and promoting endogenous neurogenesis and angiogenesis. In conclusion, this project is aiming at investigating the therapeutic effect and the mechanism of ADSCs derived NPCs transplantation in ICH model rats, which may provide reliable scientific basis for further clinical application.

目前对脑出血患者的神经功能康复尚无有效的治疗方法。脂肪干细胞可被诱导分化为神经前体细胞，移植后在脑内具有多向分化和再生神经元的能力，且具有易大量获取、可自体移植、无免疫排斥反应、不涉及伦理学问题等优势。本项目拟采用携带绿色荧光蛋白基因的慢病毒转染大鼠脂肪干细胞，在体外特定条件下将其诱导分化为神经前体细胞，通过立体定向注射将其移植到脑出血模型大鼠侧脑室内，观察大鼠神经功能恢复情况；采用国际首创的显微光学切片断层成像系统（MOST：可清晰显示全脑神经元三维网络结构，骆清铭等，Science，2010），观察移植细胞在脑内的存活、增殖、迁移和分化，并进一步研究其可能的作用机制：减轻早期炎症反应，减少神经细胞死亡，外源性神经发生和突触形成，促进内源性神经、血管发生等。本项目旨在探索脂肪干细胞来源的神经前体细胞移植对于脑出血的治疗效果及其作用机制，为进一步的临床应用提供切实可靠的科学依据。

脑出血（ ICH）是常见的具有高致死率和致残率的神经系统疾病，目前临床多以血肿清除和对症支持治疗为主，但仍无法有效解决脑出血后的神经损伤后遗症问题。脂肪干细胞（ADSC）是一种来源丰富、易于提取的间充质干细胞，具有跨胚层多向分化潜能，近年来其在治疗神经系统疾病中的作用开始得到关注。但关于脂肪干细胞治疗脑出血的研究尚不多见。本项目以此为研究点，旨在探究脂肪干细胞治疗脑出血的有效性及其作用机制。我们首先查阅大量文献，对干细胞移植治疗脑出血的临床前期研究进行系统评价和meta分析，对干细胞疗法的现状及主要结论进行统筹把握。接着我们从人腹部皮下组织和SD大鼠腹股沟区皮下组织中分离提取脂肪干细胞，并通过表面抗原检测和成脂成骨诱导分化能力对其成分及纯度进行鉴定。在体外特定条件下脂肪干细胞可被诱导分化为神经前体样细胞和神经元样细胞，表达神经元表面标记分子和初具神经元的功能。我们采用胶原酶法构建c57小鼠的脑出血模型，通过立体定向经皮层和灶周局部注射等途径移植脂肪干细胞，发现脂肪干细胞移植后可显著改善脑出血后神经功能恢复，减少神经元的凋亡和促进血管再生，减轻神经炎症反应和维持血脑屏障的完整性。我们分别采用FeSO4、Hemin、LPS和神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞共培养体外模拟脑出血模型，实验发现，脂肪干细胞可以通过抗神经炎症、免疫调控、减轻水肿等多重作用机制发挥对脑出血的保护作用。我们利用显微光学断层成像技术（MOST）成功构建了小鼠脑出血灶周的精密脑三维图谱。为进一步观察脂肪干细胞移植后在体内的分布、迁移和存活，提高干细胞治疗的效率，我们构建稳定过表达CX3CR1的脂肪干细胞进行移植治疗脑出血，发现可在一定程度上提高干细胞的归巢率，增加治疗的有效性。原计划在移植后通过MOST技术在全脑范围内可视化、高分辨、三维立体地动态观察移植细胞在结构和功能上的修复作用，但由于脑出血急性期血肿干扰特异性荧光染色，不太适合进行MOST成像，而移植的脂肪干细胞在体内的存活时间有限，故我们只对移植后干细胞的短期存活、增殖、分化和迁移情况进行了相关检测。此外，我们还进一步研究发现脂肪干细胞来源的神经前体细胞（ NPCs）还可对大鼠坐骨神经损伤发挥保护作用。