不同糖链的强心苷对Na+/K+-ATP酶 α2 亚型的选择性抑制作用研究

Na+/K+-ATPase is the molecular target of cardiotonic drugs. Its alpha subunit has four isoforms. In myocardial cells, the alpha1 isoform was uniformly distributed, while the alpha2 isoform mainly exists in the T-tubule, which is key site for excitation contraction coupling. The common cardiotonic drug digoxin has low selectivity and can induce cardiac arrhythmias through the targeting on alpha1 isoform. Our preliminary study showed that the sugar type and length of sugar chain determined the selectivity on alpha2 isoform, and the selective alpha2 isoform inhibitors only target the T-tubule, which will not induce the elevation of Ca2+ concentration uniformly in myocardial cells, and showed better safety. Based on the previous research, this project aims to isolate, identify and modify the cardiac glycosides with different sugar chain from Asclepias curassavica L., Adonis amurensis Regel et Radde and Helleborus thibetanus Franch., determine the inhibitory activities against the alpha1/alpha2 isoforms, look for the selective inhibitors against the alpha2 isoform, evaluate the cardiotonic effect and safety in vivo, and elucidate the selectivity mechanism though investigation of the interactions between cardiac glycosides and alpha2 isoform by nuclear magnetic resonance and mass spectrometry. This project will provide lead compounds for the development of selective cardiotonic drug with high efficiency and low toxicity.

Na+/K+-ATP酶是强心药的靶标，其α亚基有四种亚型。在心肌细胞中，α1亚型均匀分布，但α2亚型主要存在于T-小管（为兴奋和收缩偶联的关键位点）。地高辛等强心药的选择性低，无可避免地作用于α1亚型，导致心肌细胞内Ca2+浓度的普遍上升并诱导心率失常。我们前期研究显示，强心苷的糖基种类和糖链长度决定其对α2亚型的选择性，而且选择性α2亚型抑制剂只作用于T-小管，不会导致心肌细胞内Ca2+浓度的普遍上升，具有较好的强心效果和安全性。本项目拟在前期研究的基础上，从马利筋、福寿草和铁筷子中分离、鉴定和修饰带有不同糖链的强心苷，测定对α1/α2亚型的抑制活性，寻找对α2亚型有选择性的抑制剂，评价其体内强心作用和安全性，并用核磁共振谱和质谱研究强心苷与α2亚型的相互作用，阐明其对α2亚型的选择性机制，为开发高效低毒的选择性强心药提供先导化合物。

Na+/K+-ATP酶是强心药的靶标，其α亚基有四种亚型。在心肌细胞中，α1亚型均匀分布，但α2亚型主要存在于T-小管（为兴奋和收缩偶联的关键位点）。地高辛等强心药的选择性低，无可避免地作用于α1亚型，导致心肌细胞内Ca2+浓度的普遍上升并诱导心率失常。我们前期研究显示，强心苷的糖基种类和糖链长度决定其对α2亚型的选择性，而且选择性α2亚型抑制剂只作用于T-小管，不会导致心肌细胞内Ca2+浓度的普遍上升，具有较好的强心效果和安全性。..本项目在前期研究的基础上，从马利筋、福寿草和铁筷子中分离、鉴定强心苷40个，采用酶催化修饰的方法，又获得不同糖链的强心苷20个。我们随后测定了这些强心苷对α1/α2亚型的抑制活性，发现强心苷的苷元无选择性，但其糖基化产物对NKA α2亚型的选择性均增强；乙型强心甾二糖基化产物3b对NKA α2亚型选择性为3.07；甲型强心甾三糖基化产物7c对NKA α2亚型选择性为5.04；我们用2-氯-4-硝基苯酚苷为糖供体构建核磁探针分子，再用核磁共振研究强心甾与其靶标Na+/K+-ATP 酶的相互作用，发现强心甾的糖基部分参与相互作用，且C-3位糖基为构型的强心苷强于α构型的强心苷；分子对接研究表明，乙型强心甾与酶的相互作用与核磁共振研究一致。我们也用分子对接法模拟甲型强心甾类化合物与 Na+/K+-ATP 酶的相互作用，结果表明，相对于强心甾的乳酸酯，二氧六环型强心甾体（C3-糖基与C2连接而成）与Na+/K+-ATP酶可以形成更多的氢键，结合更加牢固，从而解释了其较强的Na+/K+-ATP酶抑制活性。.总结：通过本项目的化学和生物学综合研究，已分离天然强心苷40个；通过结构修饰，得到不同糖链的衍生物20个；通过活性筛选，得到新药先导化合物两个（3b, 7c）；此外，本项目已申请发表论文5篇（均已标注），申请中国发明专利1项，培养博士生1名、硕士生3名。 ..因此，本项目已完成预期的研究计划和研究目标。