对映-贝壳杉烷二萜介导拟南芥生长素极性运输的分子调控机制

To date, more than 200 thousand plant secondary metabolites have already been described, which play a crucial role in plant competition and community establishment. Ent-kaurene diterpenoids are the main secondary metabolites in genus Isodon and have various specific molecular structures; nevertheless, little is known on mechanisms how they regulate plant growth and development. Particularly, the exact mechanisms of ent-kaurene diterpenoids on polar auxin transport are still unknown. Polar auxin transport is not only required for formation of auxin concentration gradients that is of importance for plant growth and development, but also is strictly related to adaptability growth in response to environment changes. Thus, studying mechanisms on plant secondary metabolites mediating polar auxin transport is the key to reveal plant-plant allelopathic interactions. Here in this project a research platform will be established by Arabidopsis thaliana transgenic line of auxin polar transport carrier proteins, mutants failed in influx or efflux carriers and auxin-mark transgenic line, meanwhile some techniques including Western Blotting, qRT-PCR, laser scanning confocal microscopy, high performance liquid chromatographic analysis and others will be applied. We focus on studying the mechenisim of four ent-kaurene diterpenoids on regulating subcellular localization and expression of six auxin polar transport carrier protein in hypocotyl and seedling of Arabidopsis thaliana, further to reveal their possible target genes and ultimately explain molecular mechanisms on ent-kaurene diterpenoids mediating polar auxin transport in Arabidopsis thaliana.

迄今，已发现植物次生代谢产物20余万种，它们在植物竞争和植物群落构建中发挥关键作用。对映-贝壳杉烷二萜是香茶菜属植物最主要的次生代谢产物，分子构型丰富独特，目前对它们调控植物生长发育的机制知之甚少，尤其对介导植物生长素极性运输的分子机制还完全不知。植物生长发育依赖于生长素极性运输所建立的生长素浓度梯度，植物响应环境变化进行适应性生长与生长素极性运输密切相关，研究植物次生代谢产物介导生长素极性运输机制是揭示植物之间化感作用的核心问题，但报道极少。本研究利用Western Blotting、qRT-PCR 、激光共聚焦显微镜及高效液相分析等技术，采用系列拟南芥生长素极性运输载体蛋的转基因株系、突变体及生长素分子标记株系为研究平台，研究4种不同构型二萜对拟南芥幼胚和幼苗生长素极性运输蛋白的亚细胞定位、蛋白及基因表达的调控机制，揭示可能的靶基因，阐释该类化合物介导拟南芥生长素极性运输的分子机制。

本项目从甘肃产香茶菜属植物中分离得到4种不同结构类型的对映-贝壳杉烷型二萜（leukamenin E、weisiensin B、rabdosin B 和epinodosin），通过现代波谱学方法以及单晶X-射线衍射技术对4种二萜结构进行了确定；采用经典测试植物莴苣及模式植物拟南芥评估了4种二萜的植物毒性，利用生长素运输载体突变体、融合蛋白标记株系、转基因报告株系（30余种），探究了该类二萜在不同浓度体系下介导生长素极性运输影响拟南芥种苗根生长的分子机制。分别在抑制效应、促进效应及干扰根向重力性生长效应3个方面展开了研究工作。.该类二萜显示了明显的植物毒性，在较高浓度下可显著抑制拟南芥种苗主根生长并减少侧根数；抑制PIN2, PIN3, PIN4, PIN7和 AUX1基因表达以及PIN2-GFP, PIN3-GFP, PIN4-GFP, PIN7-GFP和 AUX1-YFP融合蛋白的定位丰度，但增加PIN1表达；引起根部生长素浓度上升以及根尖生长素积累，并检测到生长素信号途径响应，减少生长素阻遏蛋白AXR表达；同时，诱导根分生区细胞周期阻滞（S/G2），有丝分裂活性下降及细胞伸长生长的抑制。上述实验证据表明，这些二萜通过干扰生长素极性运输形成根生长素积累，调节生长素信号途径导致拟南芥根的生长抑制作用。.Epinodosin显示了双重的作用效应，在较低浓度下，对主根生长和侧根发育具有显著的促进作用。较低浓度的epinodosin调节生长素极性运输转运蛋白的表达明显不同于高浓度epinodosin的调节模式。Epinodosin抑制PIN1、PIN2和PIN4表达，以及PIN1-GFP、PIN2-GFP和PIN4-GFP融合蛋白的定位丰度，但增加PIN3和AUX1表达以及PIN3-GFP和AUX1-YFP融合蛋白的定位丰度。Epinodosin引起根尖生长素减少，提高根尖皮层细胞数量，促进伸长区细胞的伸长生长，表明epinodosin通过干扰生长素极性运输使根生长素减少，导致拟南芥根的生长促进作用。.Rabdosin B和epinodosin通过调节PIN3和PIN4在细胞质膜上的不对称分布，引起根尖两侧生长素的不对称分布，进而导致根尖两侧细胞不对称伸长，干扰根向地性生长。.上述结果为植物次生代谢产物影响植物生长发育提供了新的证据和思路。