香茶菜属植物对映-贝壳杉烷类二萜化合物抗肿瘤活性及机理的研究

目前从香茶菜属植物中已分离得到的400多种对映-贝壳杉烷型二萜化合物，它们的抗肿瘤活性已得到充分肯定，但其作用机理尚不清楚，相关研究非常欠缺。本项目在对该类化合物结构科学分类和准确确定的基础上，在细胞体系下，通过形态学观察、流式细胞技术、彗星电泳法、末端标记法、拓扑异构酶活性检测、分子免疫技术、荧光探针等技术和方法展开对不同骨架的该类化合诱导癌细胞生长抑制和致死的研究；同时在非细胞体系下，通过紫外光谱、荧光光谱、圆二色谱、激光拉曼谱法检测不同骨架化合物与DNA和蛋白质的直接作用方式。揭示这类化合物抑制细胞生长、干扰细胞周期、致癌细胞凋亡可能的作用靶标及信号转导途径，为最终阐明该类化合物的抗癌机理积累基础资料，为科学利用该类化合物提供科学依据。

本项目分别在细胞和非细胞2个不同的研究体系，以及4个研究层次（生物大分子相互作用，生物大分子损伤，凋亡信号通道，遗传毒性）展开对映-贝壳杉烷型二萜的抗肿瘤作用机制的研究。. 完成了14种单体化合物的细胞毒性及其对单细胞DNA损伤的测试，计算了代表性分子的静电势，系统研究了它们的构效关系，确定了分子结构的抗肿瘤活性关键特征。研究显示，α-亚甲基环戊酮结构是该类化合物最重要的活性中心；对于C-1位具羟基的C-20未氧化型化合物，C-18位的羟基取代使其活性下降约10倍，C-18和C-20位均有羟基取代其活性下降100倍以上，失活效应极高，这可能与基团空间位阻和分子静电势改变相关；受试化合物的活性规律表现为C-20未氧化型＞C-20氧化型＞螺环内酯型＞延命素型。 . 光谱学研究（紫外、荧光光谱、圆二色、激光拉曼）显示，受试化合物与牛血清白蛋白/肌动蛋白和小牛胸腺DNA/质粒DNA有较强的结合能力，能较大程度地改变蛋白质的二级结构，并对DNA有较强的损伤作用；培养细胞测试显示，这些化合物对细胞骨架有解组装作用，细胞骨架可能是蛋白质损伤的重要靶标。. 受试的四种化合物Wangzaozin A、Rabdosin B、Weisiensin B和Leukamenin E对Hela、HepG2、AS、HL-60和K562有较强的抗细胞增殖和诱导凋亡能力；并可通过诱导细胞内活性氧产生，上调P53蛋白质表达，激活周期阻滞，以及改变Bcl-2/Bax蛋白表达量，使线粒体释放细胞色素C，从而激活Caspase-3及其下游Caspase蛋白，导致细胞凋亡发生。同时， 甘肃特产总序香茶菜叶的醇提物（主要含多种二萜及熊果酸）对S180和H22荷瘤小鼠移植性肿瘤也显示了极显著的抑制效应，并显示了与单体化合物相一致的细胞生长及凋亡信号途径。. 代表性化合物Wangzaozin A不能诱导正常细胞HUVEC和癌细胞HL-60形成微核，其染色体的致畸率与对照相比没有显著性差异，评估其遗传毒性为极低。. 综上，受试化合物的抗肿瘤活性机制可表述为：受试化合物通过与细胞内蛋白质或DNA结合，改变其空间结构或形成损伤，通过某种机制导致活性氧事件产生，激活癌细胞G1或S或G2周期阻滞信号通路，抑制癌细胞生长，或激活线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。