纤连蛋白在调控角膜缘干细胞命运中的作用初探

Microenvironment interacts with stem cells and regulates cell fate. Fibronectin, a key extracellular matrix component in microenvironment, has been linked to various stem cell behaviors. However, there has been very little progress in how fibronectin controls self-renewal, proliferation, and homeostasis of limbal stem cells. Recently, we demonstrated that fibronectin regulated proliferation and differentiation of limbal stem cells through Wnt/β-catenin and Wnt/PCP signaling pathways. Here, we hypothesize that interactions between fibronectin and the Wnt signaling pathways regulate limbal stem cell fate. We use limbal niche cells that overexpress or knock down fibronectin as feeder layers, analyzing changes of Wnt signaling pathways in limbal stem cells. We further apply keratoplasty to limbal stem cell deficient New Zealand rabbit, detecting the association between fibronectin and key protein expressions in Wnt pathways. Our work reveal the underlying molecular mechanisms of fibronectin’s regulation of limbal stem cell fate, providing strong support for development of better therapeutic strategies of limbal stem cell deficiency and further application of stem cell therapy and regenerative medicine.

微环境对干细胞命运的调控具有重要作用，其中纤连蛋白是微环境中发挥调控作用的关键细胞外基质成分。目前纤连蛋白在维持角膜缘干细胞自我更新和分化的动态平衡中的调控机制仍不清楚。前期我们发现纤连蛋白可通过Wnt/β-catenin和Wnt/PCP信号通路影响角膜缘干细胞的增殖和分化。基于此，我们提出“纤连蛋白与Wnt信号通路之间的交互作用”很可能构成一种新的调控机制，进而来调控角膜缘干细胞的命运。本课题拟以角膜缘微环境中的支持细胞作为饲养层，通过过表达和敲除饲养层细胞的纤连蛋白，研究其对角膜缘干细胞Wnt信号通路的调控作用；并利用角膜缘损伤动物模型联合角膜缘移植术，分析角膜缘修复过程中纤连蛋白与Wnt信号通路关键蛋白表达的相关性；通过体外和体内的研究阐明纤连蛋白对角膜缘干细胞命运的调控机制，为临床角膜缘干细胞缺陷症的治疗及其再生医学研究奠定理论基础。

微环境对干细胞命运的调控具有重要作用，其中纤连蛋白（Fibronectin，FN）是微环境中发挥调控作用的关键细胞外基质成分。目前FN在维持角膜缘干细胞自我更新和分化的动态平衡中的调控机制仍不清楚。前期我们发现FN可能通过Wnt经典通路和非经典通路共同作用，以调控角膜缘上皮干细胞的增殖和分化。基于此，我们提出“FN与Wnt信号通路之间的交互作用”很可能构成一种新的调控机制，进而来调控角膜缘上皮干细胞的命运。本研究以体外分离和培养的兔角膜缘上皮干细胞（rLESC）为研究对象，通过外源添加和shRNA敲降FN表达的手段，研究其对角膜缘上皮干细胞Wnt信号通路的调控作用。结果发现，12.5µg/cm2 FN处理的rLESC增殖能力显著高于对照组和其它浓度FN处理组，且该实验组的rLESC也能很好的维持其干性。转录组分析FN处理组的细胞Wnt4、Wnt11、Fzd1、Fzd7、Fzd9以及下游信号分子RhoA、ROCK1、ROCK2表达量显著升高；此外，细胞周期蛋白CDK2/4/6、Cyclin D1/D3/E1/E2的表达量也显著升高，而CDK抑制因子p21Cip1和p27 Kip1的表达量显著降低。通过siRNA技术检测到只有Wnt11参与了rLESC的增殖。利用免疫共沉淀实验证实Wnt11确实能与跨膜Fzd7结合；通过siRNA干扰和免疫印迹实验证明Wnt11和Fzd7的相互作用可将Wnt信号传至细胞内，上调RhoA、ROCK1/2；而通过siRNA干扰、ROCK特异性抑制剂的添加以及免疫印迹实验，结果表明ROCK1和ROCK2又能上调细胞周期蛋白CDK2/4/6、Cyclin D1/D3/E1/E2的表达，以及下调p21Cip1和p27Kip1。此外，荧光素酶报告基因检测结果也证实了FN不能激活反而抑制Wnt经典通路。综上所述，综上所述，FN能够通过Wnt11/Fzd7/ROCK的非经典Wnt信号通路增强rLESC的自我更新能力。本研究为临床角膜缘干细胞缺陷症的治疗及其再生医学研究奠定理论基础。