携带Lipocalin 2的双靶向溶瘤腺病毒治疗结肠癌干细胞的研究

结肠癌发病率高，缺乏有效的治疗手段。结肠癌干细胞是结肠癌生长和转移复发的根源，杀灭结肠癌干细胞有望治愈结肠癌，然而目前缺乏针对治疗结肠癌干细胞的研究。携带治疗基因的溶瘤腺病毒可通过感染方式进入肿瘤干细胞，且对肿瘤干细胞内的耐药机制不敏感，因此具有潜在杀伤结肠癌干细胞的作用。本实验在前期构建的能靶向结肠癌而不损伤正常细胞的ZD55溶瘤腺病毒基础上，进一步采用结肠癌干细胞特异启动子控制ZD55 E1A的表达，形成对结肠癌干细胞双重靶向的溶瘤腺病毒。同时将具有促肿瘤细胞调亡、抑制肿瘤血管生成、逆转上皮细胞间质化等抗癌作用的Lipocalin 2基因插入到该双靶向病毒中。所构建的新病毒的治疗价值要远优于单独溶瘤腺病毒治疗和单独抗癌基因治疗。它具有病毒的裂解和Lipocalin 2基因的协同杀伤结肠癌干细胞的作用，可能为结肠癌的治疗提供新的思路和方法。

结肠癌发病率高，急需寻找有效的治疗手段。结肠癌干细胞是结肠癌生长和转移复发的根源，是治疗的关键和难点，杀灭结肠癌干细胞有望为结肠癌治疗带来新希望，然而目前针对治疗结肠癌干细胞的研究缺乏。携带治疗基因的溶瘤腺病毒可通过感染方式进入肿瘤干细胞，且对肿瘤干细胞内的耐药机制不敏感，因此具有潜在杀伤结肠癌干细胞的作用。首先，通过比较多个不同的肿瘤特异性启动子在结肠癌干细胞（CD133+CD44+ HCT116细胞）中的活性，筛选得出Survivin肿瘤特异性启动子在CD133+CD44+HCT116细胞中具有较强活性，而在正常细胞QSG7701中活性极低，故Survivin启动子可用于调控基因转录，是能用于靶向结肠癌干细胞治疗的有效候选启动子。因此采用Survivin启动子控制E1A的表达，同时删除腺病毒的E1B55区，这使得治疗性腺病毒将通过两重机制靶向肿瘤细胞而不损伤正常细胞。此外，由于肿瘤干细胞表面柯萨奇病毒-腺病毒受体(CAR)的表达可能低于普通的肿瘤细胞，但是广泛分布整合素。故将治疗性腺病毒进行了更进一步重要的改造，将RGD序列插入到编码腺病毒纤毛区的基因中，这使5型腺病毒不仅可以和柯萨奇病毒-腺病毒受体(CAR)结合，而且还能与肿瘤细胞表面广泛分布的整合素结合，从而腺病毒能大量进入肿瘤干细胞。我们将采用Survivin启动子调控E1A，删除E1B55区，含有RGD和过表达抗癌基因Lipocalin-2的溶瘤腺病毒命名为Ad-survivin-zd55-RGD-LCN2，经测序和Western-blot鉴定正确后进行体外细胞学实验和体内动物学研究。结果均表明：Ad-survivin-zd55-RGD-LCN2对结肠癌干细胞具有较强的杀伤作用，其杀伤作用具有时间依赖性和浓度依赖性，其对结肠癌的生长抑制作用与其产生的细胞裂解效应和促肿瘤细胞凋亡相关。