角膜缘微环境细胞通过NOTCH信号通路支持角膜缘干细胞的研究

Limbal stem cells (LSCs) maintain the stability of ocular surface. Limbal stem cell deficiency (LSCD) is one of the most serious ocular surface disease that could result in blindness. LSCs localize in the microenvironment called limbal niche, consisting of supporting cells (limbal niche cells, LNCs). The destruction of limbal niche lead to exhaustion of LSCs. LNCs cultured in vitro are mutipotent and exhibit the phenotype similar to bone marrow niche cells(BMNCs). LNCs could support the LSCs in 3D Matrigel culture system through direct contact by SDF-1/CXCR4 signaling. However, the further mechanism between them remains unclear. BMNCs play key role in hemopoietic stem cell maintenance through Notch signaling pathway and Notch family members are expressed in the basal layers of limbal epithelia. We thus predict that LNCs could support LSCs through Notch signaling pathway. Such a hypothesis has been proved in the preliminary in vitro study in our 3D culture system. In this study, we plan to further investigate the role of Notch signaling pathway in LNCs mediated LSCs maintenance through in vitro and in vivo experiments, from the level of molecule, cell and integrity. The ultimate goal of this study is to develop new strategy for LSCD treatment based on understanding the mechanism of LNCs mediated stem cell supporting.

角膜缘干细胞(LSCs)是维持正常眼表功能的关键，其缺乏将导致致盲性眼病。LSCs存在于角膜缘微环境细胞(LNCs)构成的微环境中，LNCs的破坏将导致LSCs的枯竭。我们前期研究表明，LNCs本身是一群多潜能干细胞，具有与骨髓造血干细胞微环境细胞(BMNCs)类似的表型，在体外三维Matrigel培养中通过SDF-1/CXCR4信号介导的直接接触支持LSCs功能，但其进一步机制尚不清楚。Notch信号通路通过细胞之间的直接接触激活；BMNCs通过Notch信号通路来支持造血干细胞功能，而且Notch家族成员已被证明在角膜缘上皮基底层表达，因此我们假设LNCs也通过Notch信号通路来支持LSCs，该假说已经在预实验中得到初步证明。本项目拟通过体内、外实验，从分子、细胞及整体水平来进一步阐明LNCs通过Notch信号通路支持LSCs的功能，为LNCs治疗角膜缘干细胞缺陷症奠定理论基础。

角膜缘上皮干细胞(LESCs)是维持正常眼表功能的关键，各种原因所引起的干细胞损伤、缺失或缺乏将导致视力下降或致盲性眼病。LESCs存在于角膜缘微环境细胞(LNCs)构成的微环境中，角膜缘微环境参与LESCs的调控，在其自我更新、多向分化和维持稳态的过程中发挥重要作用。角膜缘微环境细胞(LNCs)是一群多潜能干细胞，前期研究表明，LNCs参与阻止LESCs的分化，而其中机制尚不明确。Notch信号通路是通过相邻细胞之间直接接触从而调控细胞分化的重要信号通路之一，众多研究显示，该通路的活化在干细胞分化过程中发挥了重要调节作用。本课题组利用三维干细胞支持培养模型培养LESCs，采用阻断及激活实验定量分析LNCs体外支持LESCs功能与Notch信号通路mRNA及蛋白水平的相关性，并通过大鼠角膜缘干细胞损伤模型，验证LNCs移植保护角膜缘干细胞的效果及其与Notch信号通路的相关性。研究结果总结如下：通过免疫荧光染色和实时荧光定量PCR，确定了Notch家族成员(受体Notch1，配体Delta1、Jagged1)在角膜及角膜缘组织的表达；分别采用DispaseⅡ消化法和Collagenase A消化法获取LESCs和LNCs；LNCs阻止体外培养的LESCs分化和增殖，且抑制了Notch信号在LESCs的表达；通过阻断及激活实验，发现LNCs通过抑制Notch信号通路来阻止LESCs的体外分化和增殖；动物实验表明LNCs移植可有效促进LESCs缺乏的恢复。本课题通过建立LNCs调控LESCs的体内体外模型，从微环境角度探讨了LNCs支持LESCs的分子机制，研究成果在干细胞微环境调控领域具有普适性，有望推动成体干细胞微环境调控的理论发展。组织工程为角膜缘干细胞缺乏(LSCD)的眼表重建带来新的契机，在体外培养过程中通过调控Notch信号通路来减少LESCs终末分化，可为角膜上皮组织工程的发展提供一定的理论支持。