角膜缘微环境细胞(LNC)通过干细胞因子(SCF)信号通路支持角膜缘干细胞的研究

Limbal stem cell (LSC) is the origin of cornea epithelial cells, which is the key factor for the stability of ocular surface. The deficiency of LSC, termed as limbal stem cell deficiency (LSCD) is one of the most serious ocular surface disease that could definitely result in blindness. LSC localize in the microenvironment consists of supporting cells, such microenviroment is also called limbal niche, while the supporting cells called limbal niche cell(LNC), the destruction of limbal niche lead to exhaustion of LSC and onset of LSCD. LNC cultured in vitro exhibit phenotype similar to bone marrow-derived mesenchymal stem cell (BMMSC). LNC could support the LSC in 3D Matrigel culture system but the mechanism remains unclear. BMMSC play key role in hemopoietic stem cell maintenance through stem cell factor (SCF) signaling pathway,we thus predict that LNC could support LSC through SCF signaling pathway, LNC transplantation is efficient treatment for LSCD. Such a hypothesis has been proved in the preliminary in vitro study. In this study, we plan to further investigate the role of SCF signaling pathway in LNC mediated LSC maintenance through in vitro and in vivo experiments, from the level of molecular, cellular and integrity. The ultimate goal of this study is to develop new strategy for LSCD treatment based on understanding of LNC mediated stem cell supporting mechanism.

角膜缘干细胞是维持正常眼表功能的关键,其缺乏将导致致盲性眼病。角膜缘干细胞存在于角膜缘微环境细胞（LNC）构成的微环境中,微环境细胞的破坏将导致角膜缘干细胞的枯竭。LNC是一群多潜能干细胞,具备骨髓来源间质干细胞（BMMSC）特性,在体外实验中可以支持角膜缘干细胞功能，但两者之间的细胞间信号传递机制尚不清楚。研究表明，BMMSC是造血干细胞的微环境细胞，通过分泌干细胞因子（SCF）来支持造血干细胞功能,因此我们推测LNC也可能是通过SCF信号通路来支持角膜缘干细胞，该假说已经在预实验中得到初步证实。本项目拟通过体内、外实验，从分子、细胞及整体水平来进一步阐明LNC通过SCF信号通路支持角膜缘干细胞的功能，以期为LNC治疗角膜缘干细胞缺乏疾病的临床应用奠定基础。

1..项目的背景.角膜缘微环境细胞（LNC）是一群多潜能干细胞，具备间质干细胞（MSC）特性，在体外实验中可以支持角膜缘干细胞功能。研究表明，BMMSC 是造血干细胞的微环境细胞，通过分泌干细胞因子（SCF）来支持造血干细胞功能，因此我们推测 LNC 也可能是通过 SCF 信号通路来支持角膜缘干细胞，本项目拟通过体内、外实验进一步检验这一假说。.2..主要研究内容：.1）体外实验：LNC分离、培养及鉴定；角膜缘切片及培养细胞免疫荧光染色检测SCF及C-kit的表达情况；采用阻断（siRNA）实验分析LNC体外支持角膜缘干细胞功能与SCF信号通路mRNA及蛋白水平的相关性。.2）制作碱烧伤兔LSCD模型，采用球结膜下注射细胞（CellTracker™ CM-DiI标记）的方法，连续观察LSCD的严重程度差异。.3..重要研究结果、关键数据.1）流式细胞仪分析显示LNC表达MSC干细胞标志物CD73、CD90、CD105水平均高于BM-MSC（P＜0.01）。SCF主要表达于基质层及基底层上皮细胞，C-kit主要表达于上皮细胞层。LNC表达SCF而角膜缘上皮细胞表达C-kit。ELISA分析显示LNC培养上清液中SCF平均浓度显著高于BM-MSC细胞（P＜0.01）。Western Blot分析显示LNC细胞表达SCF水平为BM-MSC细胞的2.5倍（P＜0.01）。在3D立体共培养体系中，LNC较BMMSC能更好支持LSC，表现为p63α表达高而CK12低（mRNA）（P＜0.01），而SCF表达siRNA阻滞的LNC不具有支持LSC的功能。.2）建立了碱烧伤兔LSCD实验动物模型。在损伤后2周可以检测到角膜瘢痕形成、新生血管长入、角膜上皮结膜化及荧光素钠染色阳性。采用这种动物实验模型，设置空白对照组、BMMSC治疗组和LNC治疗组，发现两种细胞治疗组均可以减轻LSCD严重程度，LNC治疗组优于BMMSC组。表现为角膜混浊程度减轻、新生血管面积减小、印迹细胞学角膜杯状细胞密度减少、角膜上皮荧光素钠染色减轻。活体荧光显微镜发现移植后的LNC主要集中在结膜下，在1个月的时候有向角膜迁移现象。.4..科学意义.本研究的结果提示LNC移植可以减轻碱烧伤引起的LSCD，其效果优于BMMSC。其机制可能包括LNC分泌更高水平的SCF因子有关。