hhex调控vpp1阳性爪蛙腹胰前体细胞发育的分子机制的研究

Making use of the novel marker gene, ventral pancreas precursor 1 (vpp1) that we have recently identified, we found that overexpression of a low dose of hhex was sufficient to convert intestinal precursor cells into vpp1-positive cells that correlated with the formation of giant ventral pancreata and generation of supernumerary islet beta cells in these tadpoles. However, hhex was not sufficient to induce the generation of vpp1 positive cells in endodermalized animal cap cells, indicating that we do not fully understand how hhex regulates endogenous vpp1 positive cell formation and what co-factors are required for hhex to specify vpp1 positive cell fate. Here, we propose four aims to investigate how hhex controls endogenous vpp1 cell fate. In Aim 1, we will define if cells expressing only vpp1, or vpp1 and hhex double positive cells, give rise to the final ventral pancreas by genetic labeling. In Aim 2, we will use ChIP to test if hhex directly binds to vpp1 promoter. In Aim 3, we will identify co-factors interacting with hhex to regulate vpp1 positive cells during gastrualtion by CoIP and mass spectrometry. In Aim 4, we will try to recapitulate the specification of vpp1-expressing cells by hhex in animal caps, which holds great potential to develop strategies to direct mammalian embryonic stem cells into pancreatic cell types including islet beta cells.

vpp1是我们首次在非洲爪蛙中获得的腹部胰腺前体细胞标记基因，该基因的同源基因在小鼠等其它模式动物中还无法找到，我们在爪蛙的整体胚胎中发现，过表达低剂量的单一转录因子hhex可以有效地将非胰腺内胚层细胞转变为vpp1阳性细胞并进而分化形成真正成熟的胰岛β细胞和巨大的腹部胰腺，但是hhex尚不能将相当于哺乳类胚胎干细胞的爪蛙胚胎前体细胞诱导形成胰腺及胰岛β细胞，主要的问题在于目前尚不了解在原肠作用期间hhex调控vpp1阳性的胰腺前体细胞发育的分子机制以及与hhex共同起作用的其它因子。本项目将用胚胎学、分子遗传学、以及生物化学的方法来系统地揭示hhex调控vpp1阳性腹部胰腺前体细胞形成的分子机制，以期实现在体外用hhex等因子诱导爪蛙胚胎前体细胞形成vpp1阳性胰腺前体细胞并进而分化形成真正成熟的胰岛β细胞，为诱导哺乳类胚胎干细胞形成真正成熟的胰岛β细胞提供依据。

在青蛙和小鼠模型中的研究均已表明原肠作用期间伴随着内胚层的形成，预定胰腺内胚层细胞的特化在同时进行。但迄今为止，在小鼠模型中尚未找到能够在原肠作用期间特异性标记预定胰腺内胚层细胞的标记基因。我们的前期研究中，利用基因芯片在非洲爪蛙胚胎中筛选到腹部胰腺前体细胞标记基因vpp1，并发现原肠作用期间Hhex活性对vpp1阳性细胞的形成是必需的，过表达低剂量的Hhex 也可以有效地将非胰腺内胚层细胞转变为vpp1 阳性细胞并进而分化形成真正成熟的胰岛β细胞和巨大的腹部胰腺。这些结果促使我们在本项目中一方面进一步对vpp1阳性细胞进行遗传标记的谱系追踪，另一方面深入探讨原肠作用期间Hhex调控vpp1阳性细胞形成的分子机制。鉴于一些遗传标记的技术在爪蛙中尚未建立，我们首先在热带爪蛙中建立了可传代的非同源依赖性的基因敲进方法，利用该方法，我们获得了vpp1: Gal4-4xUAS: Tdtomaoto-pA敲进品系。另外，我们首次在热带爪蛙中实现了可传代的基于单链寡聚核苷酸的同源重组插入，为内源的hhex和vpp1分别加上了HA和FLAG标签。利用实验室成熟的基于归巢核酸内切酶I-SceI的转基因技术，我们建立了vpp1:GFP和hhex: Tdtomato的热带爪蛙转基因品系。通过比较这两个转基因品系及vpp1: Gal4-4xUAS: Tdtomaoto-pA敲进品系的荧光表达，我们系统总结了vpp1阳性细胞的发育命运。我们用HA抗体对热带爪蛙Hhex-HA敲进品系原肠作用期间的胚胎进行免疫沉淀和质谱筛选获得了与Hhex相互作用的多个因子，通过对Hhex过表达的原肠胚进行GeneChip® Xenopus laevis 2.0 Genome Array芯片筛选，获得了多个在原肠作用期间受Hhex调控的基因。这些研究为深入理解调控预定胰腺内胚层形成的分子机制奠定了基础。