转录抑制因子RP58调控爪蛙早期神经系统发育的分子机制研究

Transcription repressor RP58 is closely associated with human chromosome 1q43-q44 deletion syndrome. Studies in mice indicated that RP58 also regulates late stage mouse embryonic brain development. RP58 is highly expressed during fibroblasts induced neuron differentiation, and plays a key role in this process. However, little is known about whether RP58 is involved in the regulation of early stage embryonic neural development. We successfully identified RP58 as a potential RA target gene by treating gastrulating Xenopus embryos with BMS453, an RA antagonist. RP58 is mainly expressed at the posterior part of Xenopus neurulae. The expression spreads to the head during the tail bud stage of development. Our preliminary data on morpholino-mediated knockdown or overexpression of RP58 in Xenopus embryos suggests that RP58 may regulate early stage Xenopus neural development. Here, we propose to further investigate the role of RP58 in early phases of Xenopus neural development including eyes, brain and neural crest. We will generate Xenopus tropicalis RP58 knockout model to characterize the mechanism of RP58 in neural development. First, we will test whether RP58 functions through RA signaling and/or histone acetylation. Second, we will study the mechanism of RP58 in early neural development by using in situ hybridization and qPCR. Finally, we will identify RP58 target genes in early embryoes by RNA-seq, ChIP-seq etc. Our study may help understand the disease development of human chromosome 1q43-q44 deletion syndrome, and may provide potential targets for in vitro reprogramming of fibroblasts into neurons.

转录抑制因子RP58与人类1q43-q44染色体缺失综合征密切相关，在小鼠中的研究表明RP58也调控小鼠胚胎晚期脑部发育，在成纤维诱导神经细胞过程中该基因高度表达，并起到关键作用，但目前对RP58是否调控早期神经系统发育还知之甚少。我们用视黄酸拮抗剂BMS453处理非洲爪蛙早期胚胎后发现RP58是视黄酸潜在靶基因。RP58主要表达于爪蛙神经胚尾端，尾芽胚阶段其表达扩展到头端。初步功能敲减和过表达分析提示，RP58参与调控爪蛙早期神经系统眼、脑、神经嵴等的发育。本项目拟在前期工作基础上，通过建立热带爪蛙RP58敲除模型，研究在胚胎发育早期RP58与视黄酸、组蛋白乙酰化的关系；通过原位杂交、RNA-seq、ChIP-seq等方法系统地揭示RP58调控爪蛙早期神经系统发育的功能及其作用机制，本项目的实施将有助于全面认识1q43-q44染色体缺失综合征的发病机理，为神经细胞的体外成熟诱导提供参考。

转录抑制因子RP58（ZNF238）作为候选因子与人类1q43-q44染色体缺失综合征关联。前期在小鼠中的研究中发现RP58参与调控Id1-4的表达来影响小鼠胚胎脑部发育，我们通过原位杂交发现rp58基因同样主要表达于爪蛙胚胎头部以及眼部区域。通过功能敲减（MO）和过表达分析，我们发现Rp58参与调控爪蛙早期神经系统眼、脑、神经嵴等的发育。另外，与rp58同源性很高的基因znf238.2在热带爪蛙胚胎中的表达模式以及过表达后造成的表型均与rp58的类似。因此，我们在热带爪蛙中建立了rp58及znf238.2单敲除与双敲除品系，这些品系非常有助于深入揭示Rp58与znf238.2调控神经系统发育的独特作用。在rp58纯合敲除的胚胎中，我们首次发现了胚胎眼部膨大的表型，原位杂交显示pax6的表达显著升高。随后我们通过ChIP-seq和ATAC-seq分析发现，Rp58在pax6，id2，hes1等基因上游的开放区域富集。推测pax6可能是Rp58参与调控热带爪蛙眼部发育的直接靶基因。由于调控元件调控基因的表达很多都是基于loop结构完成，为了更好的阐述调控元件参与基因的表达，我们利用Hi-C技术系统的检测了热带爪蛙胚胎早期发育中的三维基因组结构，发现在热带爪蛙发育过程中TAD的动态变化以及在神经系统发育中loop结构的逐渐出现。一方面有助于我们理解基因组动态结构与胚胎发育的关系，另一方面为我们研究Rp58调控基因的表达提供理论基础。另外，我们在热带爪蛙中建立了基于BE3和ABE的高效基因敲除技术平台，在癌细胞和热带爪蛙中建立了高效的基于单链重组定点插入的技术，这些方法的开发有助于在热带爪蛙中大规模建立人类疾病模型。