Ndrg1调控爪蛙胰腺、胃和十二指肠前体细胞发育的分子机制研究

In attempt to screen for retinoic acid (RA) regulated genes in Xenopus endoderm by microarray, we identified an RA direct target gene, N-myc down regulated gene 1 (ndrg1) that showed specific expression early in the archenteron roof endoderm cells. A previous vital dye staining based fate mapping study revealed that Xenopus archenteron roof endoderm cells later give rise to dorsal pancreas, stomach, and duodenum. Our further studies indicate that RA activated Ndrg1 represses canonical Wnt pathway, thus allows the formation of pancreas, stomach, and duodenum precursor cells. However, how Ndrg1 inhibits canonical Wnt pathway in Xenopus endoderm remains unclear. Based on our current data, we propose two aims here. In Aim 1, we will define the fate map of the early ndrg1 positive cells by making use of genetic labeling. In Aim 2, we will identify Ndrg1 interacting component(s) of the Wnt/β-catenin pathway in the archenteron roof endoderm cells by CoIP and mass spectrometry. Then, we will define the functional domain of Ndrg1, which interacts with the identified canonical Wnt signaling component and inhibits Wnt/β-catenin pathway. The proposed studies hold great potential to develop strategies to direct embryonic stem cells into pancreatic cell types including islet beta cells.

通过基因芯片筛选的方法，我们首次发现视黄酸信号通路的直接靶基因ndrg1特异性地表达在爪蛙神经胚的原肠腔顶端内胚层细胞，前人用活性染料染色进行细胞谱系追踪表明爪蛙胚胎的这部分细胞将来发育形成背部胰腺、胃和十二指肠。我们进一步的研究揭示视黄酸激活的Ndrg1是通过抑制经典Wnt信号通路来保证爪蛙正常的胰腺、胃和十二指肠前体细胞的形成，但Ndrg1在爪蛙胚胎中是怎样抑制经典Wnt信号通路的有待研究。本课题在目前工作的基础上，一方面用遗传标记的方法精确追踪早期ndrg1阳性细胞的发育命运；另一方面，用胚胎学、分子遗传学、以及生物化学的方法来系统地揭示Ndrg1在爪蛙胚胎中抑制经典Wnt信号通路的分子机制，以期为体外选择性诱导胚胎干细胞形成胰腺前体细胞并进一步形成真正成熟的胰岛β细胞提供依据。

多种信号通路怎样有机地整合起来决定不同的胚胎细胞的命运是发育生物学研究的核心问题之一，视黄酸信号通路和经典Wnt信号通路都参与早期内胚层细胞的形成和特化。在前期研究中，我们通过基因芯片筛选的方法，首次发现了视黄酸信号通路的直接靶基因ndrg1，该基因特异性地表达在爪蛙神经胚的原肠腔顶端内胚层细胞，前人用活性染料染色进行细胞谱系追踪表明爪蛙胚胎的这部分细胞将来发育形成背部胰腺、胃和十二指肠。我们进一步的研究揭示视黄酸激活的Ndrg1 是通过抑制经典Wnt 信号通路来保证爪蛙正常的胰腺、胃和十二指肠前体细胞的形成。但Ndrg1 在爪蛙胚胎中是怎样抑制经典Wnt 信号通路的有待研究。本课题在前期工作的基础上，旨在一方面用遗传标记的方法精确追踪早期ndrg1 阳性细胞的发育命运；另一方面，深入揭示Ndrg1 在爪蛙胚胎中抑制经典Wnt 信号通路的分子机制，以期为体外选择性诱导胚胎干细胞形成胰腺前体细胞并进一步形成真正成熟的胰岛β细胞提供依据。我们用TALEN介导的基因敲除方法，获得了ndrg1敲除的热带爪蛙品系，该品系非常有助于深入揭示Ndrg1调控发育的作用。本项目实施初期，由于用于遗传标记的基因敲进技术在爪蛙中尚未建立，我们首先在热带爪蛙尝试建立该技术并成功建立了可传代的非同源依赖性的基因敲进方法，利用该方法我们正在构建标记ndrg1用于谱系追踪的基因敲进品系。另外，我们在热带爪蛙和非洲爪蛙中建立了基于CRISPR/Ca9的高效基因敲除技术平台。我们的研究使得热带爪蛙成为了一种优秀的脊椎动物遗传学模型，将推动其在建立人类疾病模型中的应用。Ndrg1抑制经典Wnt信号通路的分子机制的研究尚在进行中。