Appl1/Akt介导的信号通路调控爪蛙胰腺、胃和十二指肠前体细胞存活的分子机制研究

Comprehensive understanding of the maintenance, differentiation, and maturation of organ primordial progenitor cells in vivo is essential for the directed induction of embryonic stem (ES) cells into various mature functional cells. Adaptor protein APPL1 mainly functions via a kind of unique early endosomes named APPL1 endosomes to mediate trafficking of several signaling pathways. It may also play a role in nuclei. Our study revealed that Appl1 is essential for the survival of Xenopus pancreas, stomach, and duodenum progenitor (PSDP) cells, which functions mainly, but not exclusive, via Akt2 signaling pathway. It remains to be investigated what are the Appl1 interacting receptors, what are the survival signals, and what are the Appl1/Akt2 downstream target proteins in this scenario. Here, we propose three aims to investigate how Appl1/Akt2 controls the survival of PSDP cells in Xenopus tropicalis. In Aim 1, we will define the dynamic subcellular localization of Appl1 protein in developing X.tropicalis PSDP cells at high resolution. In Aim 2, we will screen Appl1 and Akt2 interacting proteins in X.tropicalis PSDP cells via CoIP and mass spectrometry. In Aim 3, we will define the cellular repertoire of Appl1/Akt2 pathway via a number of in vivo and in vitro biochemistry and functional assays. We hope that our study will give hints to direct the generation of mature functional cells, such as islet β cells, from ES cells in vitro.

全面认识胚胎发育期间器官原基的维持、分化和成熟对体外诱导胚胎干细胞形成成熟的功能性细胞至关重要。接头蛋白APPL1主要位于一种独特的早期内涵体上参与多种信号通路的调控，但也可在细胞核中发挥作用。我们的研究表明Appl1/Akt2信号通路对爪蛙胰腺、胃及十二指肠前体细胞的存活必不可少，但该通路中与Appl1相互作用的受体、Appl1/Akt2下游靶蛋白以及Appl1/Akt2所介导的细胞外信号分子等均尚不清楚。另外，我们的前期研究提示，除了Appl1/Akt2通路，Appl1可能还通过其它方式调控这些细胞的存活。本项目拟在原来工作的基础上，用胚胎学、分子遗传学以及生物化学的方法系统地揭示调控热带爪蛙胰腺、胃及十二指肠前体细胞存活的Appl1/Akt2信号通路分子机制，全面认识Appl1功能，为体外诱导胚胎干细胞形成成熟的胰岛β等功能性细胞提供依据。

目前对于器官原基在特化形成之后是如何进一步生长、分化并最终形成成熟器官的过程还认识很少，全面认识这些过程对再生生物学和再生医学有重要意义。我们早期利用Morpholino反义寡核苷酸介导的敲减方法发现Appl1/Akt2介导的信号通路活性对非洲爪蛙（Xenopus laevis）蝌蚪胰腺、胃和十二指肠前体细胞的存活是必需要的。在此基础上，本项目主要研究Appl1/Akt2介导的信号通路调控热带爪蛙胰腺、胃及十二指肠前体细胞存活的分子机制。然而通过CRISPR/Cas9在热带爪蛙中破坏appl1基因后发现纯合敲除蝌蚪的胰腺、胃及十二指肠发育是正常的，造成这两种方法表型完全不同的原因尚待探究。我们利用热带爪蛙ptf1a/p48:3xHA-tdTomato-pA敲入品系43期蝌蚪胰腺进行ChIP-seq分析筛选出了7个潜在的与胰腺发育及生理功能高度相关的候选基因，并正在对其逐一进行功能分析。与侯春晖教授课题组合作，我们利用Hi-C技术系统分析了热带爪蛙从囊胚早期到尾芽胚时期的基因组三维结构，结果表明在合子基因组激活（ZGA）之前的第8期，染色质的Topological associating domain (TAD)还没有形成，在s9期开始出现TADs,并随着发育的进程不断变强，为进一步研究染色质三维结构在原肠作用、神经发生及器官原基形成中发挥的作用奠定了基础。在此基础上，我们进一步分析了热带爪蛙各个组织器官的染色质三维结构特征，发现内胚层器官（胃、肝脏、胰腺和小肠）有非常独特的TADs。这些研究结果与早期胚胎发育期间获得的Hi-C结果相结合，在热带爪蛙中将有力推进研究内胚层器官发育分子调控机制的进程。