小麦禾谷孢囊线虫钙网蛋白调控寄主免疫反应的机制研究

The cereal cyst nematode (Heterodera avenae) is an important plant parasitic nematode disease on wheat, it caused serious yield losses of wheat and potential threaten to wheat production and food security in China. The Calreticulin（CRT）secreted by plant parasitic nematodes have been shown to play a role in the pathogenicity and modulation of host defenses but the mechanism of action and regulation is not clear. In this study, we investigate the function of Ha-CRT1 during the plant parasitism and pathogenicity using HIGS and over-expression. The action site of Ha-CRT1 in host cell will be tested by immunodetection and subcellular localization, research which signaling Ha-CRT1 inhabit Bax induce cell death depend on in yeast, identify the physically interact proteins of Ha-CRT1 by co-immunoprecipitation and LC-MS/MS assay, confirm the interaction between host interact proteins and Ha-CRT1 by BIFC and GST Pull Down and determine the molecular mechanism of Ha-CRT regulate host innate immunity via RNAi. The results will supply evidences to understand the interaction molecular mechanism between cereal cyst nematodes and host， supply the new evidences for the regulatory mechanisms of the host immune response by plant nematode effector and it is very important beneficial to make decision control strategies.

小麦禾谷孢囊线虫是小麦生产上的重要线虫病害，严重威胁着我国的粮食安全。植物线虫分泌的钙网蛋白（Calreticulin）在致病和抑制寄主免疫过程中起着关键作用，但作用机理和调控机制尚未明确。在前期研究基础上，通过HIGS和过表达技术解析禾谷孢囊线虫钙网蛋白Ha-CRT1在寄生和致病中的关键作用，采用免疫组织定位和亚细胞定位技术研究Ha-CRT1在寄主内的作用位点，利用酵母突变体系研究Ha-CRT1抑制Bax引起的细胞死亡所依赖的信号通路，采用免疫共沉淀结合质谱分析技术鉴定Ha-CRT1的互作蛋白，采用BiFC和GST Pull Down进行互作验证。从而明确Ha-CRT1在寄生和致病中的生物学功能和调控寄主先天免疫反应的分子机制。其研究结果将探究植物线虫致病分子机理和调控寄主PTI抗性的作用机制提供新的证据，为制定科学、合理的防控策略和保障我国粮食安全具有十分重要的理论价值和实用意义。

禾谷孢囊线虫是小麦生产上的重要线虫病害，严重威胁着我国小麦安全生产。植物线虫钙网蛋白在致病和抑制寄主免疫过程中起着重要作用。 本研究从禾谷孢囊线虫中克隆出钙网蛋白（calreticulin）HaCRT1和HaEXPB2两个新基因。HaCRT1基因与南方根结线虫Mi-CRT蛋白具有 89% 的一致性，与小麦TaCRT蛋白具有 55%的一致性。 HaCRT1可以抑制Bax引起的细胞凋亡。HaCRT1在侵染后二龄幼虫表达量最高；HaCRT1定位于内质网上。体外 RNA干扰沉默 J2 幼虫的 HaEXPB2 后接种小麦，二龄幼虫的侵染率明显下降。HaCRT1基因在拟南芥中超表达T3代植株形态与野生型一致，但接种丁香假单胞杆菌（Pseudomonas syringae）后，超表达T3拟南芥对P. syringae的敏感性增强。经flg22 处理后，与野生型相比免疫响应基因 PAD 、WRKY33 、FRK1 和WRKY29都不同程度受到了抑制；ROS积累量明显低于野生型植株，表明禾谷孢囊线虫的HaCRT1可降低拟南芥的免疫防御反应。超表达HaCRT1可提高植物胞内Ca2+浓度，显示CRT1参与正调控植物细胞内Ca2+积累。克隆处扩展效应蛋白新基因HaEXPB2。该基因在侵染后二龄幼虫表达量最高；定位于细胞壁；该基因具有纤维素结合特性，通过CBMII结构域与纤维素底物结合。利用体外RNAi技术沉默J2幼虫的HaEXPB2后, 二龄幼虫的侵染率比对照下降了53%。感病小麦品种温麦19 接种孢囊线虫后第1, 3和8天（dpi）的根组织进行RNA-Seq测序分析，基于功能注释和GO分析发现，氧化还原过程，抗性诱导和抑制，代谢，转运相关基因可能参与温麦19与线虫的互。研究结果初步揭示了HaCRT1通过抑制寄主基础免疫防御来促进线虫寄生机制，为小麦孢囊线虫病害的绿色有效防控提供了理论依据。