β-葡萄糖醛酸苷酶内外切底物催化识别的分子机制

Glycyrrhizin (GL) can be converted into more valuable derivatives mono-β-glucuronide-glycyrrhizin and glycyrrhetinic acid by β-glucuronidase from Aspergillus terreus, however, molecular mechanism of endo-exo β-1，2 and β-1，3 glycosidic bonds of GL has been unknown which is difficult for seperation. In order to improve the enzyme bond specifity and catalytic efficiency, conserved domain, nonconserved domain and catalytic center of AtGUS will be mutated according to three-dimentionalstrucuture of AtGUS by X-ray. Library of mutated enzymes would be constructed. Enzymes with high activity and only one product will be modeled relationship of the three-dimentional crystal structure and mutated sequence and then the molecular mechanism research of endo-exo catalyase substrate of β-glucuronidase will be revealed. This research can provide theoretical basis of endo-exo molecular recognitionof glycyrrhizinand will provide practical instruction of glycoside compounds biological modification.

土曲霉的β-葡萄糖醛酸苷酶（AtGUS）在转化甘草酸的同时，生成了具有更高价值的单葡萄糖醛酸基甘草次酸和甘草次酸，但产物是混合物导致后续分离很困难。由于该酶同时外切甘草酸的β-1, 2糖苷键和内切β-1, 3糖苷键的分子识别机制不清楚，致使很难进行理性设计该酶，从而催化生成单一的产物，为此本研究拟采用X-射线衍射技术对AtGUS进行晶体结构解析，分析其结合结构域和催化结构域，并对该酶的保守结构域、非保守结构域及催化识别中心分别进行改造，得到AtGUS重组基因文库，进行原核表达及其酶学特性研究，筛选催化底物特异性好、催化效率高的突变酶，利用生物信息学的方法分析其催化特性改进的原因，进而从分子水平揭示AtGUS如何识别底物甘草酸的内外切糖苷键分子识别机制。本研究将为糖苷酶的内外切特性转换的定向改造提供理论依据，也为糖苷类化合物的高效生物转化提供实践指导。

课题组前期从土曲霉Aspergillus terreus Li-20克隆到β-葡萄糖醛酸苷酶AtGUS-WT，并在大肠杆菌中实现了异源表达，通过对该酶的C-末端非保守序列65aa截除研究，得到了酶活提高3.2倍的突变体AtGUS-3t，但酶结构对催化功能的影响机制仍不清晰，需要进一步研究。另外，AtGUS-3t水解甘草酸的催化产物存在杂泛性问题。本课题基于其生物信息特征，从分子水平上对该酶的底物识别催化机制进行探讨，并通过理性设计的方法对AtGUS-3t进行了催化性能改造，从而提高了其催化效率和底物特异性。主要结果如下：.（1）基于多序列比对、结构比对和分子对接的方法对β-葡萄糖醛酸苷酶识别催化底物的催化机制进行了分析，并用定点突变的实验方法进行了验证。确定了高度保守的Glu416和Glu507位点是AtGUS酶的催化位点，Asp163、His334、Asp457、Phe472、Lys571是酶结合底物甘草酸的必要氨基酸残基。.（2）基于催化结构域TIM桶loop区域的理性设计，探究了关键位点对酶催化性能的影响。结构分析表明，位于活性位点附近loop7和loop8上的保守残基Thr512和Arg565与底物可形成氢键，通过定点突变获得了比活力提高了1.78倍的突变体T512S和底物特异性明显提高的突变体R565E。Arg565位点突变为带负电荷的谷氨酸，其催化产物只有GAMG。.（3）对突变酶进行纯化并进行催化特性分析，结果表明，突变体T512S（Km 0.136 mmol/L）对底物甘草酸的亲和力比野生酶（Km1.549 mmol/L）提高了，催化效率（kcat/Km 152.33±3.50 mmol-1·L·s-1）是野生酶（kcat/Km 10.94±0.15 mmol-1·L·s-1）的13.92倍。突变体R565E（Km0.192 mmol/L）对底物甘草酸的亲和力提高了，催化甘草酸转化生成GAMG的产率为85%，水解反应终止时GAMG的产量是野生酶的7.32倍。