NLRP3炎症小体和γ-干扰素在小鼠钙化性主动脉瓣狭窄的作用及其相关性研究

NLRP3 inflammasome is an intra-cellular protein complex, NLRP3 promote the maturation and secretion of IL-1β and IL-18, and then cause inflammation response which are associated with a spectrum of disorders. Activation of NLRP3 could induce autoimmune response primarily mediated by T cells. It suggested that IFN-gamma can specifically inhibit the activation of NLRP3 inflammasome. Our preminiry research showed that the expression of NLRP3 、 IL-1β and IFN-gamma increased in patient with calcified aortic stenosis .But the role of NLRP3 inflammasome and the relationship with IFN-gamma in CAS have not been reported. This project is to establish the change of NLRP3 inflammasome during the time course of CAS murine model and the relationship between NLRP3 inammasome and IFN-gamma. Using IFN-gamma antibody and IFN-gamma recombinant adenovirus vector, we aim to observe the pathological changes of aortic vavular and the influence to the NLRP3 inflammasome . What's more, this study aim to elucidate the interaction between NLRP3 inflammasome and IFN-gamma.This project will further provide new clues for clarifing the pathogenesis of CAS and therapeutic targets of CAS from a new perspective of NLRP3 inflammasome.

NLRP3炎症小体是一种胞内蛋白复合体，可促进IL-1β和IL-18成熟及分泌，引发炎症反应,且激活的NLRP3炎症小体可诱导以T细胞为主的自身免疫反应。研究提示IFN-γ能特异性抑制NLRP3炎症小体的活化。我们的预实验结果显示CAS病人NLRP3及IL-1β表达增加，CAS病人血清IFN-γ升高，但NLRP3炎症小体在CAS中的作用及其与IFN-γ相关研究尚未见报道。本项目建立CAS小鼠模型，探讨IFN-γ及NLRP3炎症小体在小鼠CAS中的变化及其相关性；通过转染IFN-γ腺病毒及注射抗IFN-γ抗体，观察CAS小鼠主动脉瓣膜病理及NLRP3炎症小体的变化，探讨NLRP3炎症小体与IFN-γ的相互作用及机制。本项目从NLRP3炎症小体这个新角度，为探索CAS的发病机制、寻求治疗靶点提供新线索。

背景：钙化性主动脉瓣狭窄(CAVS）是最常见、发病率最高老年获得性瓣膜疾病，炎症参与瓣膜钙化进展过程。病理下NLRP3炎症小体激活进行组装导致IL-1β剪切成熟和细胞损伤和死亡。IFN-γ在特定环境下具有抗炎和负向调节免疫应答作用，但IFN-γ对NLRP3作用及机制尚未阐明。.方法：应用Apoe-/-敲除小鼠喂高脂饲料建立CAVS小鼠模型。观察不同时期主动脉瓣、脾脏和外周血巨噬细胞/单核细胞上NLRP3通路变化，以及IFN-γ和Th1细胞变化并进行相关性分析。观察NLRP3抑制剂CY-09对瓣膜钙化、巨噬细胞数量和表型影响。利用IFN-γ过表达慢病毒和抗IFN-γ中和抗体阻断观察对瓣膜钙化和NLRP3通路影响。在体外Th1细胞和巨噬细胞共培养观察IFN-γ对NLRP3通路作用及机制。.结果：CAVS组峰值跨瓣速度和瓣膜钙化在24和36周显著升高，瓣叶分离程度显著下降。在24和36周脾脏炎性Ly6C+外周血单核细胞比例显著升高；主动脉瓣、巨噬细胞和炎性单核细胞中NLRP3通路激活；外周血血清中IL-1β含量在36周高于对照组。CAVS组Th1比例在第36周高于对照组和第12、24周亚组；外周血中血清IFN-γ含量在24、36周显著升高。瓣膜内NLRP3与IFN-γ平均光密度值在CAVS进展中呈正相关。NLRP3抑制剂CY-09干预显著改善CAVS组病情，并且抑制瓣叶中NLRP3通路激活；阻断NLRP3炎性体可显著减少成骨钙化分子RUNX2、SPARC和BMP2，但不影响营养不良性钙化分子CDH11和α-SMA表达水平、凋亡细胞数量。CY-09 降低 M1/M2 巨噬细胞比例和瓣膜中IL-6 和 TNF-α表达。过表达IFN-γ瓣膜功能和钙化程度与空白组相比显著下降，而阻断IFN-γ则显著改善。过表达IFN-γ抑制瓣膜内和外周血和脾脏Ly6C+单核细胞和巨噬细胞上NLRP3表达，而阻断IFN-γ则显著激活NLRP3通路。Ox-LDL激活巨噬细胞NLRP3通路；Th1可以分泌IFN-γ作用于IFNγR1/R2-STAT1级联下调NLRP3表达。.结论：本研究揭示NLRP3通路在CAVS进展过程中作用机制，IFN-γ下调CAVS中主动脉瓣和巨噬细胞/单核细胞中NLRP3通路激活。Th1可以分泌IFN-γ作用于IFNγR1/R2-STAT1级联通路下调巨噬细胞中NLRP3通路