β-葡萄糖醛酸苷酶同源寡聚至单体的催化结构演变

The synthesis of an intact homo-oligomeric enzyme needs repeat translation and folding, while it often displays "half-site reactivity" in catalytic process, which leads to the problems of poor preparation efficiency and wasted catalytic sites of homo-oligomeric enzymes. The reverse conversion from homo-oligomeric enzymes to monomers with stable catalytic function could break through the bottleneck of homo-oligomeric enzymes in industrial preparation and application essentially. Hence, in this project, based on the crystal structure of β-glucuronidase from Aspergillus oryzae (PGUS), we perform the study about the transition mechanism of catalytic structure from homo-oligomers to monomers. The tetrameric PGUS is transformed into a monomer by subunits interface analysis and site-directed mutagenesis. The transition rules of catalytic motif from tetrameric to monomeric PGUS are studied in depth by means of enzyme properties, catalytic motif analysis, molecular docking and molecular dynamics simulation. Based on this, the monomeric PGUS was modified and optimized rationally. The above work will also provide a new insight into the rational modification of other homo-oligomers.

同源寡聚酶的制备需经多次重复翻译和折叠才能组装成一个完整的酶分子，其催化过程又往往存在“半数位点反应性”的催化特征，导致同源寡聚酶的制备效率低和催化活性位点浪费的问题。如果能将同源寡聚酶逆向转换为具有稳定催化功能的单体酶，则能够从本质上解决同源寡聚酶高效制备与应用中的这一瓶颈问题。为此，本项目以课题组前期解析的β-葡萄糖醛酸苷酶同源四聚体的晶体结构为基础，开展同源寡聚酶演变为单体酶的催化结构转换机制的研究。结合亚基界面作用力分析和定点突变，将β-葡萄糖醛酸苷酶的同源四聚体演变为稳定的单体；通过对演变过程的酶学特性和催化结构分析，并利用分子对接和动力学模拟揭示其同源寡聚态至单体的催化结构演变规律；在此基础上，对β-葡萄糖醛酸苷酶的单体酶进行理性改造和结构优化，以获得催化效率高、结构稳定的单体酶。研究为创建其它同源寡聚酶演变至高效单体酶的理性改造方法提供新思路。

同源寡聚酶在催化过程中往往存在“半数位点反应性”的催化特征，原因在于亚基之间存在变构调节作用，这导致其活性位点无法得到充分利用。将同源寡聚酶解聚并维持其原有的催化功能，能够释放其催化容量，提高活性位点的利用率。为此，本研究提出同源寡聚调控策略提高寡聚酶催化效率的新思路。一方面，将具有“半数位点反应性”的β-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS）同源四聚体演变为二聚体，通过四聚体解聚和二聚体重构研究其催化构型的变化，并在此基础上进行二聚体的结构改造；另一方面，对PGUS四聚体进行有序组装，获得稳定高效的PGUS多聚体。首先，通过对PGUS四聚体的亚基界面分析和突变体的设计，获得三个对PGUS四聚体解聚起关键作用的氨基酸位点H515, W522和E524；通过对三个位点在亚基内部的局部作用网络进行分析，确定H515为最佳突变位点，该位点的突变能够在破坏亚基间作用力的同时，最大程度地维持亚基内部的催化结构和功能；H515位点的极性氨基酸取代能够更好地优化亚基内部的局部作用网络；但PGUS二聚体几乎完全丧失了催化天然底物GL的功能，仅保留了对小分子底物pNPG的催化活性。其次，通过在PGUS二聚体W522A的C末端融合短肽GGC，实现了PGUS同源二聚体至四聚体的重构，并进一步通过引入DTT和GSSG，在体外氧化还原体系中实现了PGUS四聚体和二聚体之间的转换；PGUS重构四聚体在一定程度上恢复了对底物GL的催化功能，催化结构比对发现二聚体中底物通道“塌缩”导致其活性口袋变小，基于此，对二聚体H515D底物通道的关键氨基酸进行饱和突变，获得一个具有GL催化功能的PGUS二聚体。最后，通过在PGUS四聚体的C末端融合自组装标签，实现了PGUS四聚体的有序组装，得到稳定且具有高活性的PGUS多聚体。该项目开发的同源寡聚调控策略为改善寡聚酶的工程化应用提供了新思路。