CRISPR序列对德氏乳杆菌抗噬菌体侵染机制的研究

针对"噬菌体污染"这一导致发酵乳制品生产失败的关键问题，基于德氏乳杆菌基因组中的CRISPR功能研究的空白，采用一系列分子生物学手段探讨该结构抗噬菌体侵染的能力。筛选出基于噬菌体诱导CRISPR序列变化而产生的抗噬菌体突变株，通过敏感性实验证实其高效的抗噬菌体侵染能力，并通过一系列生理实验检测其遗传稳定性，为该菌株在发酵生产中的应用提供理论基础。另外，本课题还将筛选出德氏乳杆菌噬菌体，通过鸟枪法对其进行全基因组测序；并应用ClusterW、MEGA4和BioLayout等生物信息学软件对乳酸菌CASS系统提供量化分析。其意义在于，目前德氏乳杆菌CRISPR具有抗噬菌体侵染的能力均为假设阶段，本项目将填补该领域的研究空白，构建成基于CRISPR作用的突变株将为发酵生产提供高效抗噬菌体侵染的发酵剂菌株，提高工业发酵效率和产品品质。

酸奶等发酵乳制品具有优质口感和多种益生功能，备受消费者青睐。然而，在酸奶生产过程中，经常因发酵剂的噬菌体污染导致发酵失败，招致经济损失。应用分子生物学手段能从根本上控制噬菌体的侵染，已发现具有CRISPR序列的嗜热链球菌可有效地防止侵染，但此序列的作用在德氏乳杆菌保加利亚亚种中未见报道。本研究以标准菌株的CRISPR为基础对KLDS-DICC保藏的8株嗜热链球菌和10株德氏乳杆菌进行了CRISPR序列的扩增和测序，通过生物信息学手段对其序列组成、同源性和二级结构进行了分析和预测；并针对588株乳酸菌进行了CRISPR序列的查找和整理，应用生物信息学和系统发育分析方法对CRISPR结构的系统发育进行了研究，并分析了其DR序列、cas1基因与16s rDNA等的系统发育和进化学关系，建立了比较全面完整的乳酸菌CRISPR数据库。供试嗜热链球菌和德氏乳杆菌大多具有CRISPR序列，其DR序列二级结构呈回文结构。根据系统发育分析结果，乳酸菌的CRISPR数据库分为11簇，其属内进化相对保守。cas1基因与DR序列共进化，与16s rDNA进化不相关。另外分别筛选抗噬菌体的嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种突变菌株，然后进行EOP、遗传稳定性、溶源性检测，通过菌株与噬菌体的相互作用研究其抗噬菌体能力及作用机制，结果表明其抗性均非CRISPR中插入spacer序列而引起，而是干扰吸附和R-M系统在发挥作用。最后分别测定遗传稳定的2株德氏乳杆菌保加利亚亚种和2株的嗜热链球菌的抗性突变菌株的发酵性能，结果发现4株抗性菌株的发酵活菌数、产酸能力都与野生菌株相似，且制作的发酵乳黏度和硬度也与野生菌株无明显差别，适于作为酸奶发酵菌株，可应用于生产实际。本研究为CRISPR在乳酸菌中以及原核生物中的比较基因组学和系统发育及进化等方面的研究奠定基础。项目成果的直接经济意义是获得出抗噬菌体能力强的酸奶发酵剂菌株，降低酸奶发酵时因噬菌体侵染导致的发酵失败，这将为企业带来巨大的经济效益，具有广阔的应用前景。