基于重测序的大丽轮枝菌毒性靶标基因的筛选与功能研究

大丽轮枝菌可侵染如棉花、番茄等重要经济作物产生黄萎病，造成严重的经济损失。已有证据表明大丽轮枝菌毒素是造成黄萎病的主要因素，但由于毒素含量低，成分复杂，研究还停留在传统的生理生化水平上，对于毒素组分和作用机制尚不清楚。本项目将根据申请者已完成的高毒菌株VdGh.991全基因组测序和78株不同致病力菌株重测序结果，系统分析分泌蛋白基因的差异与致病性的关系，筛选大丽轮枝菌关键毒性靶标基因并鉴定其功能。前期分析工作表明VdGh.991编码潜在分泌蛋白基因806个。本研究将利用基因组测序结果，深入分析分泌蛋白基因集SNP、InDel和特异基因情况，结合致病性差异筛选潜在毒性分泌蛋白基因；同时定量PCR分析基因在侵染过程中的表达变化情况，确定候选毒性分泌蛋白基因；采用基因过表达和定点突变技术研究基因对致病性的影响，确定毒性靶标基因并鉴定其功能，最终为大丽轮枝菌毒素的功能和致病机理研究提供理论依据。

黄萎病是世界上重要的植物检疫病害和棉花生产的第一大病害，给农业生产带来巨大损失。已有证据表明大丽轮枝菌毒素是造成黄萎病的主要因素，但对于毒素组分和作用机制尚不清楚。本项目以大丽轮枝菌基因组数据和种群重测序数据为基础，开展了大丽轮枝菌潜在分泌蛋白基因的遗传变异和毒力功能研究，取得如下结果：1）通过重测序数据与参考基因组比较分析鉴定了全基因组范围内的单核苷酸变异以及基因缺失情况；2）以大丽轮枝菌编码806个胞外分泌蛋白基因为参考，通过单核苷酸变异与来源菌株毒性关联分析，确定了23个候选分泌型毒力基因，鉴定出了8个在高毒力种群特有的基因分泌型毒力基因；3）定量PCR分析发现与毒力关联的分泌型毒力基因有22个在侵染过程中被显著诱导表达，参与了病原的侵染过程；4）鉴定了4个候选毒力基因VdSSP1、HSSP、VdEG1和VdEG3的功能，这些基因缺失后突变株对棉花的致病力均显著下降，VdEG1和VdEG3纯化蛋白对烟草具有诱导坏死活性。上述研究为大丽轮枝菌利用胞外分泌蛋白参与致病的分子机理提供了理论依据，也为利用种群重测序数据研究病原其他生物学特性提供借鉴。