大丽轮枝菌分泌的RNA沉默抑制子的鉴定与功能研究

RNA silencing plays a significant role in antiviral and antimicrobial defense in plants. To counteract the host defense, plant viruses, pathogenic bacteria and oomycetes have evolved RNA silencing suppressors to disrupt the host RNA silencing machinery. However, it remains unclear whether effectors secreted by fungi can attack RNA silencing-mediated plant defense. Before starting the project, VdRSS1, one secreted protein of Verticillium dahliae, was identified as a RNA silencing suppressor and localized primarily in the nucleus of epidermal cells of Nicotiana benthamiana plants. To gain a better insight into the function of VdRSS1, we will evaluate the role of VdRSS1 in the vegetable growth and virulence of V. dahliae by gene knock-out and complementation assays. Electrophoretic mobility shift assay and MST analysis will be performed to analyze the binding affinity of VdRSS1 to different types of small RNAs, which can be further used to conclude its targeting step in the RNA silencing pathway. Furthermore, RNA-Seq and Small RNA-Seq will be performed to profile the expression of both miRNAs and mRNAs in the transgenic plants over-expressing VdRSS1 and wildtype plants. Finally, an integrative analysis of differentially expressed miRNAs and mRNAs will be carried out to draw a network regulated by VdRSS1. Accomplishment of the project will not only decipher the mechanism of VdRSS1, but also provide a new perspective to understand the arms race between pathogenic fungi and their hosts, which can shed light on other pathogenic fungi.

RNA沉默是植物抵御病原微生物侵染的一种重要机制，而病毒、细菌和卵菌均可进化出RNA沉默抑制子来克服这种防御反应，但尚不清楚真菌是否也编码RNA沉默抑制子来干扰寄主的防御反应。本项目前期从大丽轮枝菌中发现1个定位于植物细胞核的分泌蛋白VdRSS1能够抑制RNA沉默。为深入研究该蛋白的功能和作用机制，拟通过基因敲除和互补实验明确VdRSS1在大丽轮枝菌生长发育和致病中的作用；分析VdRSS1与不同类型Small RNA的结合能力，阐明其作用于RNA沉默途径的可能阶段；通过测定野生型和转基因过表达VdRSS1的拟南芥的转录组和Small RNA，分析差异表达的miRNA和mRNA，并利用miRNA与靶标mRNA之间的负调控关系构建VdRSS1对寄主植物的调控网络。上述研究不仅可以解析VdRSS1的功能及作用机制，也将提供全新视角去理解病原真菌与寄主的互作机制，为其它病原真菌的相关研究提供借鉴。

RNA沉默是植物抵御病原微生物侵染的一种重要机制，参与了植物对病毒、细菌、卵菌和真菌等多种病原微生物的防御反应；而这些病原微生物也能进化出RNA沉默抑制子来对抗这种防御反应。但是与植物病毒相比，其它非病毒类病原微生物（细菌、卵菌和真菌）与寄主RNA沉默途径之间的相互作用研究还相对比较滞后。本项目在前期发现大丽轮枝菌中1个效应蛋白VdRSS1具有抑制寄主局部RNA沉默功能的基础上，进一步明确了VdRSS1可以抑制S-PTGS而不能抑制IR-PTGS的功能，进而阐明了VdRSS1抑制寄主次级小干扰RNA的生成的可能作用机制；通过基因敲除和回补实验明确了VdRSS1不影响该菌正常的营养生长、孢子形态及孢子萌发等特性，但VdRSS1敲除突变体（ΔVdRSS1）与野生型菌株Vd8相比对寄主的致病力却明显下降；在烟草叶片中瞬时表达VdRSS1可以促进PVX，灰葡萄孢菌，辣椒疫霉在内的其它病原微生物对寄主的侵染，揭示了VdRSS1具有干扰寄主先天免疫防御反应的能力；通过比较分析野生型和转基因过表达VdRSS1的拟南芥中差异表达的miRNA，发现VdRSS1可以影响拟南芥中参与调控寄主防卫反应的部分miRNA的生成，影响相关下游基因的表达。上述研究成果表明VdRSS1是大丽轮枝菌分泌的一个重要的具有RNA沉默抑制子功能的效应蛋白，可以通过影响寄主miRNA的生成来干扰寄主的先天免疫防御反应以促进病原菌的侵染，在该菌的致病过程中发挥了重要作用。上述结果还表明在寄主中表达具有抑制寄主RNA沉默功能的效应蛋白是包括植物病原真菌在内的几乎所有植物病原微生物影响寄主RNA沉默防卫反应的重要策略之一。在Environmental Microbiology，International Journal of Food Microbiology，Plant Disease和棉花学报等期刊上发表了5篇研究论文，申请了1项国家发明专利，培养了博士研究生1名，硕士研究生1名。