大丽轮枝菌RXLR效应子候选基因VdRXLR1的致病功能研究

The Ascomycete fungus Verticillium dahliae Klebahn causes vascular wilt disease across over 200 plant species, including many high-value crops, such as cotton, patato, tomato, etc. Due to great genetic plasticity and fast host range expansion in V. dahliae population, the molecular mechanism for the pathogenicity is still largely unkonwn. Based on our preliminary results, a RXLR effector candidate named VdRXLR1 was obtained through comparative genomic analysis between the high-virulent strain VDG1 and the low-virulent strain VDG2. RXLR effectors, first isolated from malaria and oomycete pathogens, are defined by a conserved motif, termed RXLR (for Arg, any amino acid, Leu, Arg) and implicated in host translocation. Gene knock-out of VdRXLR1 caused reduced virulence up to 50%, indicating its contribution to the virulence in V. dahliae. To further investigate the gene function, we propose a serial of experiments including gene expression analysis under different inductions, signal peptide validation, cell re-enty and protein uptake assay to define the basic features of VdRXLR1. To address whether VdRXLR1 can trigger the host cell death or suppress the hypersensitive response induced by elicitor INF1, VdRXLR1 will be transiently expressed in the host alone or challenged by the PAMPs elicitor INF1. Beside, complementary assays in the mutant⊿VdRXLR1 and the low-virulent strain VDG2 will be conducted to validate the role of VdRXLR1 in the virulence. Furthermore, we will transient express the VdRXLR1 with FLAG-tag in tobacco leaves and perform Co-Immunoprecipitation (Co-IP) and LC-MS/MS analysis to identify the host factors directly interacting with VdRXLR1. Data generated from our proposed project will provide clues regarding the role of VdRXLR1 in the pathogenicity and locate the pathway VdRXLR1 involved during V. dahliae-host interaction.

大丽轮枝菌（Verticillium dahliae Kleb）是严重危害棉花等重要经济作物的维管束病害，其致病机制至今尚不明晰。在前期研究中，通过对高、低毒菌株全基因组比较分析，在大丽轮枝菌中首次发现了一个高毒菌株特异的具有致病效应的RXLR效应子候选基因VdRXLR1。RXLR效应子是在疟原虫和卵菌中发现的一类含有RXLR宿主靶向结构域的具有致病功能的分泌蛋白。基因敲除实验表明?VdRXLR1 突变株毒力比野生型降低了50%以上。为进一步研究VdRXLR1的致病功能，本项目拟从基因表达分析，信号肽及RXLR结构域功能验证解析VdRXLR1的基本基因特性；通过诱导坏死及宿主超敏反应抑制实验阐释VdRXLR1的致病功能；同时，通过筛选与VdRXLR1相互作用的宿主靶标蛋白，初步提出VdRXLR1的致病途径与调控网络，为进一步阐明由VdRXLR1介导的大丽轮枝菌致病机理奠定基础。

大丽轮枝菌是引起棉花、茄子、黄瓜等多种农作物在内的200多种植物产生黄萎病的土传性病原真菌，导致的维管束病害给农作物尤其是棉花生产造成巨大破坏。大丽轮枝菌在与寄主协同进化、异核融合和外界环境的影响下，呈现出极强的变异性，致病机理极为复杂。本研究前期对高、低毒大力轮枝菌株全基因组进行比较分析，发现了一个高毒菌株特异的具有致病效应的RXLR效应子候选基因VdRXLR1,基因敲除实验表明∆VdRXLR1 突变株毒力比野生型降低了50%以上，基因回补后可有效恢复其致病力。进一步研究发现，VdRXLR1基因全长1708 bp，编码506个氨基酸，N端具有1个信号肽序列。基因表达分析发现，VdRXLR1在正常条件(蔗糖为唯一碳源)下不表达，但受植物细胞壁组分(淀粉为唯一碳源3 d、果胶为唯一碳源5 d) 诱导表达，在大丽轮枝菌侵染棉花胚轴组织5d后被诱导表达，表明VdRXLR1可能与植物细胞壁组分的降解利用及病原菌的侵染过程密切相关。酵母信号肽跟踪实验表明，VdRXLR1信号肽可介导毕赤酵母蔗糖酶分泌到胞外，表明VdRXLR1属于分泌蛋白。通过烟草中瞬时表达实验，发现VdRXLR1既不能诱导烟草细胞坏死，也不能抑制由其它激发子引发的烟草细胞超敏反应，以上结果表明VdRXLR1可能不直接识别宿主细胞受体参与早期信号传导反应。同时，通过酵母体外表达体系将VdRXLR1蛋白进行表达和纯化，并将纯化的蛋白注射到棉花叶片中, 发现VdRXLR1无法类似于NLP1诱导棉花叶片发生坏死反应，说明单一的VdRXLR1蛋白对棉花没有毒性。同时，将VdRXLR纯化蛋白直接注射到烟草叶片中，与瞬时表达结果一致，该蛋白无法诱导烟草叶片发生坏死反应。分析烟草中NbEDS1等同源抗病基因转录本情况表明，VdRXLR仅抑制了激酶信号通路基因NbMKK1、NTF1、MEK1和SIPK基因的表达。有报道表明，过表达烟草激酶信号通路基因如NbMKK1可以诱导烟草细胞死亡，VdRXLR可能通过抑制了NbMKK1等激酶信号通路基因的表达避免了激发先天免疫反应，无法引起细胞死亡。因此，推测VdRXLR1通过抑制植物的激酶信号通路促进了病原菌的侵染，是大丽轮枝菌的毒力因子。.